[发明专利]一种靶向抗癌基因-质粒及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因治疗药物，具体地说属于一种靶向抗癌基因-质粒及其构建方法和应用。

背景技术

基因治疗是近十多年兴起的一种生物技术方案，在整个基因治疗中，肿瘤基因治疗方案占60％以上，基因治疗被认为是人类最终征服肿瘤的希望，目前作为基因治疗的载体分为病毒型和非病毒型两大类。病毒载体包括：腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒和疱疹病毒。病毒载体转染率高，表达时间长，但免疫源性强，有一定危险性。非病毒载体包括：裸DNA、转染试剂包裹的DNA。随着体内转染方法及转染试剂的发展，非病毒载体由于其免疫原小、安全性好、使用方便、可大规模生产等优点，倍受人们瞩目。近年来，一种新的多聚阳离子化合物—多聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)为基因转移提供了一条有效的新技术途径，PEI分子具有分子量大小不同的聚合物，在体外细胞转染实验中，一致认为25KD的PEI转染效率较高且毒性较低，在工作浓度(1.29～6.45μg/mL)下，毒性评级为0～1级。由于PEI/DNA复合物结构稳定，且易于通过呼吸道屏障，近年来，通过雾化方式进行基因转移已经成为呼吸道基因治疗和免疫的一种有效途径。如Nyce等通过雾化吸入反义寡核苷酸治疗小鼠哮喘(Nature,385:721-725,1997)，但在癌症治疗方面仍然没有重大突破。

发明目的

本发明的目的就在于提供一种操作简单，成本低廉，同时又具有很高抗癌活性，可用于基因治疗操作的重组基因-质粒。

本发明的另一个目的在于提供一种靶向抗癌基因-质粒的构建方法。

本发明的再一个目的在于提供一种靶向抗癌基因-质粒用于治疗肿瘤的用途。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种靶向抗癌基因-质粒，该基因-质粒是含有肿瘤特异性启动子的质粒，并携带有肿瘤治疗基因，所述的携带有肿瘤治疗基因，是同时携带两个不同的肿瘤治疗基因；或者是携带一个肿瘤治疗基因和一个能对肿瘤治疗基因表达产物进行修饰加工的蛋白酶基因。

一种靶向抗癌基因-质粒的构建方法，其步骤包括：将肿瘤特异性启动子，两个肿瘤治疗基因或者一个肿瘤治疗基因和一个负责对肿瘤治疗基因表达产物进行修饰加工的蛋白酶基因依次克隆到真核表达质粒中，得到靶向抗癌基因-质粒；两个基因之间以核糖体进入位点连接。

其中，肿瘤组织特异性启动子包括但不限于：端粒酶逆转录酶(TERT)启动子，甲胎蛋白(ATP)启动子，癌胚抗原(CEA)启动子，前列腺特异性抗原启动子和乳腺癌组织特异性启动子。肿瘤组织特异性启动子的使用，使抗癌基因的表达特异地在肿瘤细胞中进行而不在正常细胞内进行。

所述的肿瘤治疗基因包括但不限于：肿瘤坏死因子超家族中的TRAIL基因、抑癌基因、细胞因子基因、促细胞凋亡基因，毒素蛋白基因、血管抑制基因和自杀基因和其它基因。

所述抑癌基因为p53、PTEN、Rb、NF1、VHL或APC；所述细胞因子基因为IL-2、IL-12、IL-24、GM-CSF、INF-α、INF-β、INF-γ；所述促细胞凋亡基因为TRAIL、Smac、Omi、Bax、Caspase-3、Caspase-7或Eorf4；所述毒素蛋白基因为蜂毒肽melittin、蝎毒BMK、核糖体失活蛋白gelonin、芋螺毒素CTX；所述自杀基因为cd或tk；所述血管抑制剂基因为血管内皮抑素、血管生成抑素k1-4、血管生成抑素k1-3、血纤维蛋白溶酶原k5或sflt-1。

所述蛋白酶基因包括但不限于：肠激酶轻链蛋白(Enterokinaselightchain)基因、凝血酶(Thrombin)基因、Xa因子(FactorXa)基因、烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEVprotease)基因、人鼻病毒3C蛋白酶(HRV3CProtease)基因。

本发明构建的靶向抗癌基因-质粒，可以用于开发有效治疗肿瘤的抗癌新药，也可以与其它化合物组成药用组合物，所述化合物可以是：化学治疗药物，生物毒素，免疫抑制化合物，单克隆抗体。

本发明的有益效果：

1、本发明提供的靶向抗癌基因-质粒，经细胞实验证明，抗癌基因可以特异性地在肿瘤细胞中表达并诱导肿瘤细胞凋亡。经动物实验证明，通过雾化基因治疗，可以用于肺部肿瘤的治疗。

2、本发明提供了携带两种抗癌基因或者一种抗癌基因和一种蛋白酶基因的重组真核表达质粒的构建方法，该方法简单，易于掌握。

3、本发明构建的基因-质粒，能够在肿瘤细胞内特异地表达所携带的外源基因，因此该基因-质粒具有很高的靶向抗癌作用。