[发明专利]一种奶牛金黄色葡萄球菌α-溶血素亚单位疫苗的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种奶牛金黄色葡萄球菌α‑溶血素亚单位疫苗的制备方法及应用。目的在于提供预防或治疗奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法,包括以下步骤：1)将金黄色葡萄球菌α‑溶血素蛋白的第37位的组氨酸定点突变为丙氨酸；2)将定点突变的α‑溶血素蛋白基因克隆到pET28a载体中；3)将步骤2)获得的表达载体转化E.coli BL21(DE3),诱导表达获得重组α‑溶血素蛋白；4)使用镍柱亲和层析和Resource S柱纯化步骤3)得到的重组α‑溶血素蛋白；5)将纯化得到的重组α‑溶血素蛋白与药学上可接受的佐剂充分混匀后得到奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎重组亚单位疫苗。

技术领域

本发明涉及一种奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法及应用。属于生物疫苗制备技术领域。

背景技术

奶牛乳房炎(Mastitis)是成年奶牛最普遍的感染性疾病，主要是奶牛乳腺组织受到微生物感染而引起的一种炎症，多发生于产后哺乳期，该病广泛存在于世界各地，为奶牛常见病、多发病，是造成乳制品业经济损失最为严重的疾病。引起奶牛乳房炎的病原微生物大约有150多种，主要以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌为主，这三种细菌引起的奶牛乳房炎占总发病率的90％以上，其中尤以金黄色葡萄球菌为最。

当前奶牛乳房炎的治疗方法主要是采用抗生素治疗，抗生素用于治疗奶牛乳房炎已有50多年的历史了，其在奶牛乳房炎的防治中起了一定的作用，但由于长期单一的、大剂量的不科学使用抗生素，引起了敏感性细菌的消除，耐药性细菌逐渐占了主流，尤其是金黄色葡萄球菌的耐药问题日益严重，导致了抗生素治疗收效甚微。

用疫苗来防治奶牛乳房炎具有很好的前景，首先，疫苗可以预防奶牛感染病原菌而引起乳房炎；其次，疫苗有助于降低乳腺感染的严重程度，控制亚临床型乳房炎；第三，使用疫苗防治乳房炎不会存在乳汁中抗生素残留问题；最后是操作简便，费用低廉。当前，研制成功的疫苗很少，且大都数为弱毒活菌苗或灭活菌苗，在生产实践中，对乳房炎的防治有一定作用，然而随着大规模集约化养殖的发展，人工致弱菌株存在着同源重组、自身毒力返强等潜在可能，而灭活疫苗也存在使用剂量大、免疫期短等不足，为提高传统疫苗的安全性与免疫保护力，高效、廉价的新型疫苗研制极其重要。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，简称SA)，也称“金葡菌”，是一种革兰氏 染色阳性的球菌，直径0.8μm，在显微镜下排列成葡萄串状，并可以产生金黄色的色素，并 因此而得名。金葡菌是引起慢性/隐性奶牛乳房炎的主要病原菌之一，可以极大的影响牛奶的 产量和质量，给奶制品产业带来巨大的经济损失。

金葡菌可产生多种毒素和酶。α-溶血素(α-hemolysin)，亦称α-toxin，是由金葡菌分泌的一种外毒素，是其主要毒力因子之一，具有良好的免疫原性。α-溶血素属于中空形状的β-桶状结构细菌毒素家族，相对分子质量为33,200，由297个氨基酸组成，其结构基因为h/a。α-溶血素对多种哺乳动物红细胞具有溶血作用，其机理为毒素分子插入红细胞的细胞 膜疏水区，形成微孔，破坏了细胞膜的完整性，造成细胞溶解。将α-溶血素第35位组氨酸突 变为丙氨酸后，突变体就失去了溶血活性，不具有毒性，但仍然保留完好的免疫原性，可直 接用来免疫动物，是金葡菌亚单位疫苗的重要候选蛋白之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种奶牛金黄色葡萄球菌α-溶血素亚单位疫苗的制备方法 及应用。重组蛋白与合适佐剂混合制备的亚单位疫苗与致病菌的自然感染过程相似，可促进 细胞免疫，诱导免疫记忆和引起广泛的免疫应答，产生很好的交叉保护反应，是一种更加安 全稳定、制备简单、应用方便、价格低廉的新型疫苗。

所述的重组α-溶血素蛋白来自金黄色葡萄球菌，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。