[发明专利]一种马铃薯Y病毒属病毒中和表位鉴定方法及其应用

权利要求书

1.一种马铃薯Y病毒属病毒中和表位鉴定方法及其应用，其特 征在于，该鉴定方法包括以下步骤：

S1，准备材料：准备好实验室保存的大肠杆菌DH5α菌株、Rosseta 菌株、大豆花叶病毒和马铃薯Y病毒等马铃薯Y病毒属代表毒株、 SP2/0细胞，BALB/c小鼠，购自大连宝生物公司的限制性内切酶、反 转录酶、T4DNA连接酶、EX-TagDNA聚合酶，购自美国GE公司的异 丙基-β-D-硫代半乳糖苷、Ni²⁺离子亲和层析柱，购自Sigma公司的 HRP标记的羊抗鼠酶标抗体；

S2，马铃薯Y病毒属衣壳蛋白(CP)基因的克隆：根据GenBank 中已有的马铃薯Y病毒属基因序列设计CP基因的特异性引物，以 TRIzol法抽提病毒感染植物组织总RNA，用M-MuLV反转录酶42℃ 作用1h合成cDNA第一链，以此为模板用EX-TaqDNA聚合酶扩增CP 基因，其中的反应条件为94-95℃预变性1-3min；93-95℃变性 15-20s，56℃退火30s，72℃延伸50s，进行30个循环；72℃再延伸 10min，PCR产物经凝胶纯化回收，与pMD18-T载体连接，转化大肠 杆菌DH5α感受态细胞，构建重组质粒pMD-CP；

S3，原核表达载体的构建：NcoⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒pMD-CP 和原核表达载体pET-28a(+)，凝胶纯化回收目的片段，将CP基因与 pET-28a(+)连接，构建重组质粒pET28a-CP，分别转化大肠杆菌 DH5α，经PCR鉴定和酶切鉴定后，进行测序；

S4，重组CP蛋白的鉴定：将重组质粒pET28a-CP转化至大肠杆 菌BL21，挑取单个菌落进行鉴定后扩增繁殖，采用不同的IPTG浓度、

诱导时间、诱导温度、菌液浓度、培养基抗生素浓度进行诱导表 达，优化诱导条件，比较不同表达载体以及不同表达条件的表达量， 确定最佳诱导条件，同时设立含pET-28a(+)空载体的表达菌作为 对照；

S5，重组CP蛋白的纯化：采用优化的表达条件进行大量表达， 收获菌体，冻融3次，用PBS悬浮菌体沉淀，在3-5℃的条件下 4500r/min离心9-11min，包涵体沉淀用3mol/L尿素溶液洗去大部分 杂蛋白，在4℃的条件下4500r/min离心10min，包涵体沉淀用pH＝8.0 含8mol/L尿素的裂解液室温溶解1h，在4℃的条件下12000r/min离 心20min，取上清蛋白与Ni2+-NTA填料结合0.5-1.5h，分别用pH＝8.0、 6.3、5.9的8mol/L尿素溶液洗涤去杂蛋白后，用pH＝4.5的8mol/L 尿素溶液洗脱目的蛋白，收集洗脱的目的蛋白，进行SDS-PAGE鉴定；

S6，CP蛋白单克隆抗体制备和病毒中和试验：对CP蛋白进行单 克隆抗体制备，配制1mg/ml浓度的单克隆抗体溶液；按1:20(克: 毫升)取发病叶与PBS溶液混合，用匀浆器制成病毒混悬液，3000rpm 离心4-6min，上清即为病毒液，100ml病毒液加入1mg抗体，然后通 过叶片摩擦接毒，观察发病情况，确定抗体中和活性；

S7，中和表位分析：将CP蛋白等分成3个区域，分别是A、B、 C区，每个区域约89个aa，将CP蛋白分成两个多肽，分别是CP-AB 和CP-BC，用大肠杆菌表达，用CP蛋白的单克隆抗体分别与CP-AB 和CP-BC试验；若与CP-AB反应，而不与CP-BC反应，说明该抗体识 别的抗原表位位于CP蛋白的A区；若与CP-AB和CP-BC都反应，说 明该抗体识别的抗原表位位于CP蛋白的B区；若与CP-AB不反应， 而与CP-BC反应，说明该抗体识别的抗原表位位于CP蛋白的C区。 这样，分别将10株单克隆抗体所识别的抗原表位定位在3个不同的 区域内，在确定抗原表位定位到具体的分区后，将该分区分成相互重 叠多肽，每个多肽有16个氨基酸残基，相邻多肽之间有8个氨基酸 残基的重叠，通过ELISA分析，将抗原表位定位在16个氨基酸残基 之内。

2.根据权利要求1所述的一种马铃薯Y病毒属病毒中和表位鉴 定方法及其应用，其特征在于，所述S7中，将CP蛋白等分成3个区 域，分别是A、B、C区，每个区域约89个氨基酸，将CP蛋白分成两 个多肽，分别是CP-AB和CP-BC，用大肠杆菌表达，用具有中和活性 的CP蛋白的单克隆抗体分别与CP-AB和CP-BC试验；若与CP-AB反 应，而不与CP-BC反应，说明该抗体识别的抗原表位位于CP蛋白的 A区；若与CP-AB和CP-BC都反应，说明该抗体识别的抗原表位位于 CP蛋白的B区；若与CP-AB不反应，而与CP-BC反应，说明该抗体 识别的抗原表位位于CP蛋白的C区。这样，分别将10株单克隆抗体 所识别的抗原表位定位在3个不同的区域内，在确定抗原表位定位到 具体的分区后，将该分区分成相互重叠多肽，每个多肽有16个氨基 酸残基，相邻多肽之间有8个氨基酸残基的重叠，通过ELISA分析， 将抗原表位定位在16个氨基酸残基之内。