[发明专利]一种马铃薯Y病毒属病毒中和表位鉴定方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物病理研究技术领域，尤其涉及一种马铃薯Y病毒 属病毒中和表位鉴定方法及其应用。

背景技术

植物病毒病导致每年200亿美元的经济损失。随着气候的变化、 种植模式的改变和经济活动的全球化，植物病毒病的危害逐年增加。 植物抗体(Plantibody)是通过遗传工程手段在植株内表达的重组抗 体，植物抗体技术在植物抗病研究中的应用还处在起步阶段。关于植 物病毒中和表位鉴定方法还未见报道。

马铃薯Y病毒属(genusPotyvirus)是已确定的植物病毒属中最 大的一类，有约200个种类被ICTV接受为确定成员或可能成员，占 已发现的植物病毒总数的20％，且新成员数量仍在不断增加，是种 类最多、寄主范围最广、经济意义最大的病毒属，代表毒株有大豆花 叶病毒(SoybeanMosaicVirus,SMV)和马铃薯Y病毒(PotatoVirus Y,PVY)等，其基因组末端编码病毒的衣壳蛋白(CoatProtein,CP)。 大豆花叶病毒病是大豆的主要病害，不仅影响大豆产量而去影响大豆 品种，目前还没有有效的防治手段，为此我们提出了一种马铃薯Y病 毒属病毒中和表位鉴定方法及其应用。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种马铃薯Y病毒 属病毒中和表位鉴定方法及其应用。

本发明提出的一种马铃薯Y病毒属病毒中和表位鉴定方法及其 应用，该鉴定方法包括以下步骤：

S1，准备材料：准备好实验室保存的大肠杆菌DH5α菌株、Rosseta 菌株、大豆花叶病毒和马铃薯Y病毒等马铃薯Y病毒属代表毒株、 SP2/0细胞，BALB/c小鼠，购自大连宝生物公司的限制性内切酶、反 转录酶、T4DNA连接酶、EX-TagDNA聚合酶，购自美国GE公司的异 丙基-β-D-硫代半乳糖苷、Ni²⁺离子亲和层析柱，购自Sigma公司的 HRP标记的羊抗鼠酶标抗体；

S2，马铃薯Y病毒属衣壳蛋白(CP)基因的克隆：根据GenBank 中已有的马铃薯Y病毒属基因序列设计CP基因的特异性引物，以 TRIzol法抽提病毒感染植物组织总RNA，用M-MuLV反转录酶42℃ 作用1h合成cDNA第一链，以此为模板用EX-TaqDNA聚合酶扩增CP 基因，其中的反应条件为94-95℃预变性1-3min；93-95℃变性 15-20s，56℃退火30s，72℃延伸50s，进行30个循环；72℃再延伸 10min，PCR产物经凝胶纯化回收，与pMD18-T载体连接，转化大肠 杆菌DH5α感受态细胞，构建重组质粒pMD-CP；

S3，原核表达载体的构建：NcoⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒pMD-CP 和原核表达载体pET-28a(+)，凝胶纯化回收目的片段，将CP基因与 pET-28a(+)连接，构建重组质粒pET28a-CP，分别转化大肠杆菌 DH5α，经PCR鉴定和酶切鉴定后，进行测序；

S4，重组CP蛋白的鉴定：将重组质粒pET28a-CP转化至大肠杆 菌BL21，挑取单个菌落进行鉴定后扩增繁殖，采用不同的IPTG浓度、 诱导时间、诱导温度、诱导前测D600nm值、培养基抗生素浓度进行 诱导表达，优化诱导条件，比较不同表达载体以及不同表达条件的表 达量，确定最佳诱导条件，同时设立含pET-28a(+)空载体的表达 菌作为对照；

S5，重组CP蛋白的纯化：采用优化的表达条件进行大量表达， 收获菌体，冻融3次，用PBS悬浮菌体沉淀，在3-5℃的条件下 4500r/min离心9-11min，包涵体沉淀用3mol/L尿素溶液洗去大部分 杂蛋白，在4℃的条件下4500r/min离心10min，包涵体沉淀用pH＝8.0 含8mol/L尿素的裂解液室温溶解1h，在4℃的条件下12000r/min离 心20min，取上清蛋白与Ni2+-NTA填料结合0.5-1.5h，分别用pH＝8.0、 6.3、5.9的8mol/L尿素溶液洗涤去杂蛋白后，用pH＝4.5的8mol/L 尿素溶液洗脱目的蛋白，收集洗脱的目的蛋白，进行SDS-PAGE鉴定；