[发明专利]一种灵敏检测微量细胞及组织中过氧化氢酶活性的检测方法

说明书

技术领域

本发明专利主要涉及使用化学发光法检测微量细胞及组织中过氧化氢酶的活性。

背景技术

过氧化氢酶是人体内广泛存在的一种酶，是抗氧化系统的主要组成部分。在病理条件下，我们要无时无刻的防止氧化应激反应，包括癌症，糖尿病，白内障，动脉粥样硬化，缺血性再灌注损伤，关节炎，神经退行性疾病，营养缺乏，和老化这些疾病都会引起氧化应激反应。过氧化氢在铁或其他金属离子存在下，对细胞产生氧化毒性，而过氧化氢酶催化过氧化氢为氧和水。

临床实验室越来越多得检测血浆和组织中的氧化应激生物标志物和抗氧化系统活性来检测体内氧化应激水平，作为疾病发展和预后的一个指标。而过氧化氢酶作为抗氧化系统中重要的一种酶，它的活性很大程度上代表了氧化应激的水平。

关于过氧化氢酶活性的测定现主要分为以下几种：

（1）化学滴定法

化学滴定法是一种最为经典的定量测定方法。过氧化氢酶的化学滴定法主要为高锰酸钾滴定法和碘量滴定法。根据国家标准GB/T 5522-85，使用高锰酸钾滴定法具有相对权威性，但是操作过程过于繁琐。碘量法的原理是利用H2O2能将KI中的I-氧化生成I2，以用淀粉作为滴定终点指示剂，用硫代硫酸钠滴定，计算出生成I2的量，在换算成H2O2的量。化学滴定法重复性差、紧密度低、操作繁琐、检测线低,不适于大批量的样品测定。其优点是不需要任何特殊的仪器,适用性比较广泛。

（2）光度法

紫外分光光度法原理是在紫外波长范围内,随着波长的缩短, H2O2对光的吸收逐渐增加在240nm处有一个吸收高峰,其吸光度与H2O2的含量成正比,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。单位时间内吸收的差值就是过氧化氢酶的活性。紫外分光光度法也可采用294nm处波长测定CAT的活性。

目前市场上所应用的过氧化氢酶检测试剂盒(Catalase Assay Kit)也是利用该方法来计算CAT的活性。随着科学技术的不断提高,利用CAT能催化联苯胺或者四甲基联苯胺/双氧水体系而明显呈蓝色的现象,有科研工作者将其应用在CAT活性的检测上,目前已取得一定的进展。

荧光分析法的原理是以喹啉为底物，经Fenton反应产生的羟自由基与喹啉发生芳香羟基化反应产生强荧光物质羟基喹啉，耦合过氧化氢酶催化分解H2O和O2。该方法操作较紫外分光光度计耗时段，灵敏度高。

化学发光法作为一种高灵敏性检测过氧化氢-鲁米诺产生羟自由基的体系，在特定的pH和底物浓度下快速对过氧化氢酶的活性进行检测的方法，也已经收到了各方面的重视。

（3）电化学法

电化学法主要采用极谱氧电极法，电流测定法，电泳-染色法。

极谱氧电极法通过氧气记录仪检测过氧化氢分解为氧和水时的氧气生成量，测定过氧化氢酶的活性，方法简便灵敏性高，但是对过氧化氢酶提取的要求较高。

电泳染色法利用电泳活性蛋白样品中过氧化氢酶的活性将过氧化氢分解为水和氧气，而没有被分解的过氧化氢则可使三价铁离子还原为二价铁离子的过程，通过凝胶背景鉴定过氧化氢酶活性。

（4）放射化学测定法

与滴定法类似，使用同位素标记底物，随着酶反应的进行定量检测放射标记产物。

大部分现存的过氧化氢酶检测方法大都存在检测方法复杂，检测所需样本量较大，样品提取过程复杂等情况，大部分应用广泛的方法主要为检测血液和土壤中微生物过氧化氢酶的活性。胡晓捷,等.流动注射化学发光法测定过氧化氢酶活性[J].浙江大学学报.2003.30.6.”使用鲁米诺过氧化氢反应检测过氧化氢酶活性，虽然灵敏度提高，但该方法主要应用范围在土壤中对微生物呼吸作用的研究，未在微量组织和细胞上进行测量。。

发明内容

本发明主要针对上述现有技术中检测CAT活力时，检测方法复杂，检测所需样本量较大，样品提取过程复杂等问题，提供一种可用于动物细胞和组织中过氧化物酶活力的检测方法。该方法操作简便，灵敏度高，可以用于检测动物细胞及组织在应激及干预后微量的过氧化物酶含量的变化。可检测到最低20U/ml。

该方法可主要分为以下几个步骤：

（1）化学发光法检测动物细胞核组织提取物中过氧化氢酶活性的方法，其特征在于，该方法的步骤和条件如下：

步骤一、取新鲜或超低温保存的组织和细胞，加入10% NP-40，pH为8.0的磷酸盐缓冲液，使用组织匀浆器粗提；