[发明专利]高致病性副溶血弧菌快速检测引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种高致病性副溶血弧菌快速检测引物及试剂盒，属于水产病原菌快速检测领域。

背景技术

我国是全球对虾养殖产量第一大国，2012年产量为165万吨，占全球养殖产量的40％，2013 年对虾急性肝胰腺坏死病导致全球养殖对虾减产23％，泰国减产54％，我国减产17％，广东减产 30％，养殖时间超过80天池塘的对虾急性肝胰腺坏死病发生率超过了80％，年直接经济损失超过 50亿元。近两年该病更加严重。急性肝胰腺坏死病的主要致病菌为一种特异性的副溶血弧菌，该 菌的致病性与质粒上编码的PirA和PirB毒素有关。目前对于虾类高致病性副溶血弧菌的检测，主 要采用传统的细菌分离鉴定，血清学反应及PCR检测技术，传统的细菌分离鉴定耗时长，操作复 杂，而且不能将该特异的副溶血弧菌和传统的副溶血弧菌分离开，而PCR方法能准确鉴定特异性副 溶血弧菌，但成本高，需要专业的仪器设备和技术人员，养殖生产中亟需一种能够应用于养殖现 场的、快速准确、操作简便的高致病性副溶血弧菌检测技术及其产品。

LAMP技术是由Notomi等于2000年首次建立的体外链置换核酸扩增的方法，近年来被广泛研 究、应用。它利用靶序列上6个关联区域设计的4条特异引物和1种高活性链置换DNA聚合酶 (BstDNApolymerase)，在等温条件(60～65℃)放置30～60min即可完成核酸扩增反应，反应液中 加入核酸染料SYBRGreenI或钙黄绿素，若有核酸扩增即可显示颜色反应，即时得到检测结果。 该技术具有快速高效、灵敏度高、特异性强、产物易检测、操作简单等优点。目前尚未有关于高 致病性副溶血弧菌LAMP检测技术的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高致病性副溶血弧菌快速检测引物。

本发明的第二个目的是提供能应用于现场检测的高致病性副溶血弧菌快速检测试剂盒。

本发明的技术方案概述如下：

高致病性副溶血弧菌快速检测引物，由外引物和内引物组成，所述外引物由SEQIDNO.1所 示的外引物上游引物和SEQIDNO.2所示的外引物下游引物组成；所述内引物由SEQIDNO.3所 示的内引物上游引物和SEQIDNO.4所示的内引物下游引物组成。

高致病性副溶血弧菌快速检测试剂盒，包括：

(1)TE缓冲液，其组成为20mmol/LTris-HCl，2mmol/LEDTA，溶剂是蒸馏水，pH＝8.0；

(2)BstDNA聚合酶：浓度为8U/μl的BstDNA聚合酶；

(3)LAMP反应液，每24μlLAMP反应液的组成为：2.5μl10×反应缓冲液；3μl浓度为 2.5mmol/L的dNTP；1μl浓度为5μmol/L的由SEQIDNO.1所示的外引物上游引物，1μl浓度 为5μmol/L的由SEQIDNO.2所示的外引物下游引物，1μl浓度为40μmol/L的由SEQIDNO.3 所示的内引物上游引物，1μl浓度为40μmol/L的由SEQIDNO.4所示的内引物下游引物；1μl 钙黄绿素与锰离子形成的配合物、13.5μlDEPC水；

(4)阳性对照膜片，用下述方法制成：吸取高致病性副溶血弧菌培养液将FTA膜片充分润 湿后室温干燥，放入盛有200μlTE缓冲液的洗涤管中震荡洗涤1次，每次2min，充分干燥；

(5)阴性对照膜片，用下述方法制成：吸取DEPC水将FTA膜片充分润湿后室温干燥，放 入盛有200μlTE缓冲液的洗涤管震荡洗涤1次，每次2min，充分干燥；

(6)无菌封装的FTA膜片、研磨棒、吸管，采集管，洗涤管，检测管。

本发明的优点：

(1)本发明解决了现有技术检测高致病性副溶血弧菌周期长、检测成本高、不能应用于现场 检测等问题，使检测过程能够快速有序进行，2h内即可完成所有检测操作，实现了检测过程的程 序化和标准化，操作规范，不易出错，对鱼体损伤小。

(2)本发明依据高致病性副溶血弧菌基因所设计的扩增引物能有效检测高致病性副溶血弧 菌，具有很好的特异性和准确性。

(3)采用内置染料的方法，反应结束后不用打开反应管，取出后直接肉眼观察结果，避免了 被扩增产物污染后续待检样品，提高了该试剂盒的应用可靠性。