[发明专利]目标细胞的多重捕获配体修饰的多层纳米粒柔性支架及其应用

说明书

本发明涉及一种目标细胞的多重捕获配体修饰的多层纳米粒柔性支架及其应用，其以活性大分子为交联剂，在载体基质上构建多层纳米粒子的粗糙表面，再在该粗糙表面上化学连接活性大分子，获得了多层纳米粒柔性支架，然后在该多层纳米粒柔性支架上固定多重捕获配体，得到连接有多重捕获配体的多层纳米粒柔性支架。本发明基于大分子交联法实现了简单、快速、可控的纳米粒有序多层柔性支架组装，该支架既具有纳米粒结构，又具有柔性结构，同时表现出了高粗糙度的优势，对于目标细胞，该支架表现出了极低的非特异性吸附，修饰了多价适体的支架具有极高特异性捕获效率，可制备成体外流通捕获系统应用于体外循环捕获体内目标细胞方面。

技术领域

本发明涉及一种用于循序捕获体内目标细胞的支架、包含该支架的体外流通捕获系统及其应用，尤其涉及一种用于循环捕获体内目标细胞的多重捕获配体修饰的多层纳米粒柔性支架及其应用，属于单细胞捕获技术。

背景技术

癌症致死的主要原因是部分肿瘤细胞获得侵袭能力并造成远处转移。肿瘤细胞脱落、侵袭并进入血液循环是实现肿瘤转移的最初阶段，并为最终形成肿瘤转移病灶提供了可能。理论上外周血中的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)与肿瘤的血行转移有直接关系，因此癌症患者外周血液中的CTC被视作肿瘤诊断十分理想的生物标志物。然而CTC在外周血中的数量稀少，在1mL全血中，存在大量的血细胞，相应的白细胞和红细胞分别高达4.0-10.0×10⁶和5.0-6.0×10⁹个，而CTC平均可能只有1个，因此特异性的、高效的细胞富集是CTC检测的关键问题。

CTC的富集方法主要有两类，以形态学为基础的富集和以CTC表面表达的特异性膜蛋白为识别受体的分离富集。前者是借助细胞的物理特性进行分离，典型的方法即为密度梯度法，如Oncoquick法、RosetteSep^TM分离法，这类富集均不具有特异性。对于以CTC表面表达的特异性膜蛋白为识别受体的分离富集方法，是将识别受体的捕获配体固载于载体上，利用捕获配体与特异性膜蛋白受体的相互作用，实现CTC的特异性识别和分离富集。特异性配体主要使用的是抗体，然而无论是阳性富集(如最具代表性的CellSearch方法所用的抗-EpCAM抗体)，还是阴性分选(如抗CD45抗体，或抗CD61抗体)，均不能实现特定CTC的捕获。对于特定CTC捕获的配体，当前有大量的研究者开始关注适体。适体具有亲和力高、特异性强、分子范围广、筛选制备方便、稳定性好、修饰灵活、分子量小以及无免疫原性的特点，使得适体具有代替抗体成为“化学抗体”对特定CTC进行捕获的潜能。无论对于抗体还是适体，在提高CTC特异性捕获的同时，更为关注的是提高捕获效率。当前主要采用三类手段提高捕获效率，即微流控芯片、提高固载配体的载体基质粗糙度、和多价配体键合。

对于微流控芯片技术，通过改变细胞液的流体方式和减小流体通道的截面积以增加CTC表面受体与固载于微通道中的配体之间的键合碰撞几率。在特异性识别的捕获体，即CTC-膜蛋白(受体)----配体-载体基质中，膜蛋白受体和配体分子的尺度均远远小于微米级的CTC以及更大尺度的载体基质，这种具有大尺度效应的CTC和载体基质均显著增加了配体识别受体的空间位阻。若在载体基质表面构造一定程度的粗糙度，即在表面构建众多支架，将形成高效的捕获体CTC-受体----配体-支架-载体基质，支架将减小载体基质的空间位阻，这将是提高捕获效率的另一种有效手段。