[发明专利]一种基于Indel和SSR位点技术大批量且高效开发分子标记的方法

说明书

本发明公开了一种基于Indel和SSR位点技术大批量且高效开发分子标记的方法，包括以下步骤：(1)选取至少3个待开发样品，分别提取待开发样品的DNA；(2)对各待开发样品的DNA样品进行酶切并构建测序文库并测序；(3)所有待开发样品的基因组混合后进行组装获得Contigs；(4)利用Contigs与各待开发样品个体序列进行比对，根据Indel和SSR的位点信息，获得内部存在Indel的SSR位点，作为候选多态性SSR位点；(5)根据获得的候选多态性SSR位点设计引物，PCR扩增和测序，选取带型稳定清晰条带，作为待验证分子标记引物；(6)利用所得的分子标记引物，PCR扩增不同的待开发样品，选取具有多样性的分子标记，获得分子标记。该方法提高分子标记开发的效率，且开发的SSR分子标记能高效应用于遗传学、增殖放流评估等方面的研究。

技术领域

本发明涉及分子生物学及生物信息学领域，具体涉及一种基于Indel和SSR位点技术大批量且高效开发分子标记的方法。

背景技术

分子标记是以检测生物个体在遗传物质内核苷酸序列变异所产生的差异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。分子标记在不同发育阶段的生物个体、不同组织中均一致，并且分子标记的数量越多，多态性越高，遗传就越稳定，不会受到环境的影响。与传统的几种遗传标记相比较，DNA分子标记具有很多优点。随着分子生物学的迅猛发展，DNA分子标记已有数十种，广泛应用于遗传育种、物种亲缘关系的鉴定，群体遗传多样性分析，物种增值放流评估等方面。

根据分子标记的发展，可以将其分为三代，第一代以RFLP、AFLP和RAPD为代表；RFLP和AFLP的等位基因具有共显性特点，但其实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用高；RAPD具有技术简单，检测速度快，但其不能鉴别纯合子和杂合子，实验的稳定性和重复性较差；第二代以SSR标记和ISSR为代表，它们以重复序列的重复次数为标记，其特点是易于分型，操作较为简单，为共显性标记，便于遗传分析。第三代分析标记为SNP、Indel标记等这类标记的特点是数量多、范围广，便于高通量分析。

SSR标记也称为微卫星DNA，其串联重复的核心序列为1-6bp，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。其具有以下优点：一般能检测到单一的多等位基因位点；呈共显性遗传，能区别杂合子和纯合子；所需的DNA量少；其缺点是由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高，同时筛选引物时有一定盲目性。Indel标记称为插入缺失标记，指的是两个样品中在全基因组中的差异，一个样品相对于另外一个样品基因组中有一定数量的核苷酸插入和缺失。根据插入缺失位点，两端设计一些扩增这些插入缺失位点的引物，就是Indel标记。目前，SSR是应用最多、最广的分子DNA标记，而Indel标记在水产动物育种中应用甚少。

发明内容

本发明的目的针对物种筛选SSR分子标记时效率不高的问题，提供一种基于Indel和SSR位点技术大批量且高效开发分子标记的方法。用于解决在高通量测序后SSR标记开发有效性较低的问题，该方法可很大程度上提高分子标记开发的效率，且开发的SSR分子标记能高效应用于遗传学、增殖放流评估等方面的研究，节约了大量的时间和金钱。

本发明的目的通过以下方案来实现：一种基于Indel和SSR位点技术大批量且高效开发分子标记的方法，

(1)选取至少3个待开发样品，分别提取待开发样品的DNA；

(2)对各待开发样品的DNA样品进行酶切并构建测序文库并测序；

(3)所有待开发样品的基因组混合后进行组装获得Contigs；

(4)利用Contigs与各待开发样品个体序列进行比对，检测出SNP、Indel变异信息以及SSR位点，并根据Indel和SSR的位点信息，获得内部存在Indel的SSR位点，作为候选多态性SSR位点；