[发明专利]一种砀山酥梨遗传转化方法

权利要求书

1.一种砀山酥梨遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)遗传转化受体的建立

以砀山酥梨当年生新梢为外植体，接种在愈伤组织诱导培养基表面诱导培养出愈伤组织，即为遗传转化受体；所述愈伤组织诱导培养基配方为：MS+6-BA 1.0～2.0mg/L+IBA 0.2～0.6mg/L+20～30g/L蔗糖+6～7g/L琼脂+0.1～0.2g/L活性炭，愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8～6.0；诱导培养的环境为16小时光照、8小时黑暗光周期培养室，光强1500～2000lx，温度25℃；

(2)农杆菌的培养及侵染液的配制

将带有目的基因质粒的农杆菌EHA105在LB固体培养基上划线活化，再用LB液体培养基培养至OD值达到0.6～0.8，并进行菌液PCR验证，确保质粒没有丢失，然后离心收集菌体，用液体愈伤分化培养基悬浮后培养2～3小时，即为侵染液；

(3)侵染与共培养

将愈伤组织浸泡在侵染液中，在28℃、50r/min条件下侵染10分钟，取出后用无菌滤纸吸干多余菌液，然后接种在共培养培养基上培养48～60小时；

所述共培养培养基配方为：1/2MS+6-BA 2.5～3.0mg/L+IBA 0.2～0.4mg/L+10～20g/L山梨醇+AgNO₃ 0.5mg/L+AS 0.15mmol/L；共培养温度25℃，暗培养；

(4)除菌培养与筛选培养

将愈伤组织从共培养培养基中取出，并用含有400mg/L Cef的无菌水进行清洗，然后转接在除菌培养基上培养3～6天，再转接至筛选培养基中培养，培养一个月后，存活下来的即为抗性愈伤组织；

(5)抗性愈伤组织GUS染色鉴定

将抗性愈伤组织分成两份，其中一份用于GUS染色检测，有蓝色显色反应的抗性愈伤组织认定为阳性愈伤组织，表明砀山酥梨遗传转化成功。

2.如权利要求1所述的砀山酥梨遗传转化方法，其特征在于：所述外植体选用3月至4月的砀山酥梨当年生新梢。

3.如权利要求1或2所述的砀山酥梨遗传转化方法，其特征在于：所述LB固体培养基及LB液体培养基中均附加0.5g/L Kan和0.5g/L Rif；所述液体愈伤分化培养基配方为：1/2MS+6-BA 2.5～3.5mg/L+IBA 0.2～0.4mg/L+10～20g/L山梨醇+AS 0.15mmol/L；侵染液通过稀释控制OD值在0.4～0.5。

4.如权利要求1或2所述的砀山酥梨遗传转化方法，其特征在于：所述除菌培养基配方为：1/2MS+6-BA 2.5～3.0mg/L+IBA 0.2～0.4mg/L+10～20g/L山梨醇+AgNO₃ 0.5mg/L+Cef350mg/L；除菌培养温度25℃，无光照。

5.如权利要求1或2所述的砀山酥梨遗传转化方法，其特征在于：所述筛选培养基配方为：1/2MS+6-BA 2.5～3.0mg/L+IBA 0.2～0.4mg/L+10～20g/L山梨醇+AgNO₃ 0.5mg/L+Cef300mg/L+Hyp3～5mg/L；筛选培养先暗培养10天，再转入16小时光照、8小时黑暗光周期培养室中培养，光强1500～2000lx，温度25℃，每20天在相同培养基上继代一次。