[发明专利]一种砀山酥梨遗传转化方法

说明书

本发明一种砀山酥梨遗传转化方法，包括以下步骤：(1)遗传转化受体的建立；(2)农杆菌的培养及侵染液的配置；(3)侵染与共培养；(4)除菌培养与筛选培养；(5)抗性愈伤组织GUS染色鉴定。本发明以砀山酥梨愈伤组织为受体，以NptII为标记基因，以GUS基因为报告基因，通过农杆菌EHA105介导的方法进行砀山酥梨的遗传转化，获得阳性愈伤组织，然后即可通过阳性愈伤组织再分化为试管苗；本发明首先建立起一种以砀山酥梨当年生新稍为外植体诱导出愈伤组织，进而进行遗传转化的方法，砀山酥梨春季新稍酚类物质含量低，而且携带病菌量少，接种褐化率和污染率都很低，而且取材方便，愈伤组织诱导率高，能够满足遗传转化的需求。

技术领域

本发明涉及园艺作物基因工程领域，具体涉及一种以砀山酥梨愈伤组织为受体的农杆菌介导的遗传转化方法。

背景技术

梨属于蔷薇科(Rosaceae)梨亚科(Pomaeeae)梨属(Pyrus L.)植物，是世界上重要的落叶果树之一。梨的品种可分为东方梨和西洋梨两大类，东方梨主要栽培于中国、日本和韩国等亚洲国家，包括沙梨(Pyrus pyrifolia)、白梨(Pyrus bretschneideri)和秋子梨(Pyrus ussuriensis)等。梨在中国的栽培面积和产量仅次于柑橘和苹果，位居第三位，其中原产安徽省砀山县的砀山酥梨属白梨系，是我国梨出口的主要品种之一。

梨的童期较长，利用传统的育种技术选育新的品种需要很长的时间，利用基因工程进行种质改良，将极大的缩短育种进程，加快梨新品种的育种步伐。

随着分子生物学领域技术迅猛发展，大量果树的遗传转化技术也在逐步成熟，与其他物种相比梨遗传转化起步较晚。于1988年，由Viseur等率先开始了梨属植物上的转基因工作，他用梨试管苗叶片作外植体，用带致瘤质粒的农杆菌(pTiT37)感染转化，虽然成功诱导出了瘤组织并分化出了不定芽，但最终并未能获得转基因植株。此后，各个国家的科学者对梨的遗传转化都做了进一步深入的研究，但同国外的研究相比中国关于这方面的研究比国外晚了近10年，而且在现有的报道中，梨遗传转化主要集中在西洋梨品种上，东方梨鲜有报道，特别是东方梨中的白梨，因此对白梨系品种砀山酥梨进行转基因研究十分必要。

目前，梨树组织培养中所用外植体类型包括茎尖、子叶、花药、叶柄、叶片和原生质体等，利用这些外植体均可以获得再生试管苗，但是梨试管苗生根时容易产生大量愈伤组织且生根率低，还会因为根基不够健壮导致移栽成活率低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种砀山酥梨遗传转化方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种砀山酥梨遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)遗传转化受体的建立

以砀山酥梨当年生新稍为外植体，接种在愈伤组织诱导培养基表面诱导培养出愈伤组织，即为遗传转化受体；

(2)农杆菌的培养及侵染液的配置

将带有目的基因质粒的农杆菌EHA105在LB固体培养基上划线活化，再用LB液体培养基培养至OD值达到0.6～0.8，并进行菌液PCR验证，确保质粒没有丢失，然后离心收集菌体，用液体愈伤分化培养基悬浮后培养2～3小时，即为侵染液；

(3)侵染与共培养

将愈伤组织浸泡在侵染液中，在28℃、50r/min条件下侵染10分钟，取出后用无菌滤纸吸干多余菌液，然后接种在共培养培养基上培养48～60小时；

(4)除菌培养与筛选培养

将愈伤组织从共培养培养基中取出，并用含有400mg/L Cef的无菌水进行清洗，然后转接在除菌培养基上培养3～6天，再转接至筛选培养基中培养，培养一个月后，存活下来的即为抗性愈伤组织；

(5)抗性愈伤组织GUS染色鉴定