[发明专利]基于21个线粒体SNP位点的法医学快速检测试剂盒

权利要求书

1.一种基于21个线粒体SNP位点的法医学快速检测试剂盒，其特征在于：所述的法医学快速检测试剂盒包括⑴富集引物的混合物，⑵21条单碱基延伸引物混合物，⑶扩增试剂：dNTPs和快速Taq聚合酶，⑷核酸纯化柱，⑸SNaPshot反应混合液，⑹Hi-Di甲酰胺，⑺GeneScan^TM Size Standards-120LIZ，⑻阳性对照：DNA 9947A，⑼阴性对照：ddH2O；

所述的富集引物的混合物包括用于扩增线粒体nt25～343、nt365～675、nt16132～16552、nt8158～8488、nt8504～8808和nt10285～10682六个区域的6对富集引物；所述的6对富集引物的序列及工作浓度为：

SEQ ID NO：1，0.31μM SEQ ID NO：2，0.32μM

SEQ ID NO：3，0.30μM SEQ ID NO：4，0.30μM

SEQ ID NO：5，0.36μM SEQ ID NO：6，0.34μM

SEQ ID NO：7，0.31μM SEQ ID NO：8，0.33μM

SEQ ID NO：9，0.32μM SEQ ID NO：10，0.30μM

SEQ ID NO：11，0.34μM SEQ ID NO：12，0.33μM;

所述的21条单碱基延伸引物的序列及工作浓度为：

SEQ ID NO：13，0.21μM SEQ ID NO：14，0.20μM

SEQ ID NO：15，0.22μM SEQ ID NO：16，0.20μM

SEQ ID NO：17，0.20μM SEQ ID NO：18，0.23μM

SEQ ID NO：19，0.25μM SEQ ID NO：20，0.23μM

SEQ ID NO：21，0.20μM SEQ ID NO：22，0.21μM

SEQ ID NO：23，0.22μM SEQ ID NO：24，0.25μM

SEQ ID NO：25，0.20μM SEQ ID NO：26，0.20μM

SEQ ID NO：27，0.21μM SEQ ID NO：28，0.23μM

SEQ ID NO：29，0.22μM SEQ ID NO：30，0.23μM

SEQ ID NO：31，0.23μM SEQ ID NO：32，0.21μM

SEQ ID NO：33，0.25μM。

2.如权利要求1项所述的法医学快速检测试剂盒在案件排查、个体识别以及尸源认定中的应用。

3.利用权利要求1所述的快速检测试剂盒进行个体识别检测的使用方法， 其特征在于：所述的使用方法包括以下步骤：

⑴.线粒体DNA提取：从待测生物检材中提取线粒体DNA；

⑵.复合扩增反应：取步骤⑴所得的线粒体DNA作为复合扩增模版，加入富集引物的混合物和扩增试剂，进行单管内复合扩增反应，PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性15s， 55℃退火5s，72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃延伸2min，获得复合扩增产物；

⑶.复合扩增产物纯化：用核酸纯化柱纯化步骤⑵所得的复合扩增产物；

⑷.单碱基延伸反应：取步骤⑶所得的纯化后的复合扩增产物，加入单碱基延伸引物混合物和SNaPshot反应混合液，进行单管内单碱基延伸反应，单碱基延伸反应程序为：96℃10s，50℃5s，60℃30s，共20个循环，获得单碱基延伸产物；

⑸.电泳：取步骤⑷所得的单碱基延伸产物，加入Hi-Di甲酰胺、GeneScan^TM SizeStandards-120LIZ，混合均匀后，于95℃变性3min，4℃迅速冷却后进行荧光电泳检测和基因型分析。

4.如权利要求3所述的使用方法，其特征在于：所述的使用方法步骤⑷中SNaPshot反应混合液的加入量为1～1.5μL；所述的单碱基延伸反应的总体积为5μL。

5.如权利要求3或4所述的使用方法，其特征在于：所述的使用方法步骤⑷中的纯化后的复合扩增产物的加入量为1～5ng。