[发明专利]一种花生黄色斑点病毒检测试剂盒及其检测方法与应用

权利要求书

1.一种花生黄色斑点病毒检测试剂盒，其特征在于包括盒体、硝酸纤维素膜、显色液试 剂瓶、抗体试剂瓶、对照试剂瓶；

所述的显色液试剂瓶包括显色试剂瓶A和显色液试剂瓶B；

所述的抗体试剂瓶包括一抗试剂瓶和二抗试剂瓶；

所述的对照试剂瓶包括GYSV标准阳性对照试剂瓶和GYSV标准阴性对照试剂瓶。

2.根据权利要求1所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒，其特征在于所述的硝酸纤维 素膜设有方格，方格中空白处用以点样。

3.根据权利要求1所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒，其特征在于所述的显色液试 剂瓶A含有NBT显色液；显色液试剂瓶B含有BCIP显色液。

4.根据权利要求3所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒，其特征在于所述的NBT显色液 是将0.5gNBT溶于10ml70%的二甲基甲酰胺；BCIP显色液是将0.5gBCIP溶于10ml100%的 二甲基酰胺。

5.根据权利要求1所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒，其特征在于所述的一抗试剂 瓶含有花生黄色斑点病毒特异性多克隆抗体；二抗试剂瓶含有特异性羊抗兔。

6.根据权利要求5所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒，其特征在于所述的含有花生 黄色斑点病毒特异性克隆抗体的制备是采用其N基因原核表达的方法得到免疫源，免疫家 兔获得，使用效价为1:500～20000；花生黄色斑点病毒N基因PCR扩增引物根据丁铭 （Ding.M.）注册报道的GYSV甜椒分离物N基因全序列设计（注册号为：EF528556），引物序列 及其退火温度具体见下表：

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7.根据权利要求1所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒，其特征在于所述的GYSV标准 阳性对照试剂瓶含有感染GYSV的本氏烟植物干粉；GYSV标准阴性对照试剂瓶含有健康本氏 烟植物干粉。

8.一种权利要求1~7任一所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒的检测方法，其特征在 于包括以下步骤：

1）根据检测样品数量剪下硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜的一角剪去，用以指示膜方 向。

2）检测样品加入洗涤缓冲液研磨，移液器取2.5μl研磨液点至硝酸纤维膜方框中，同 时点上标准阳性对照和标准阴性对照，室温放置或37℃放置至膜彻底干燥；

3）将膜移至容器，加入封闭缓冲液，室温或37℃封闭1h；

4）在封闭缓冲液中加入一抗，室温摇床摇匀，37℃培育1h或4℃培育过夜；

5）弃去一抗培育液，洗涤缓冲液洗膜3次，每次5min；

6）弃去洗涤缓冲液，加入封闭缓冲液，再在封闭缓冲液中加入二抗，室温摇床摇匀，37 ℃培育1h或4℃培育过夜；

7）弃去二抗培育液，洗涤缓冲液洗膜3次，每次5min；

8）弃去洗涤缓冲液，显色缓冲液洗膜1次，每次5min；

9）弃去显色缓冲液，加入显色液黑暗处显色，充分显色后将膜移至清水中终止显色，分 析并记录检测结果。

9.一种权利要求1~7任一所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒的应用，其特征在于所 述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒在检测花生黄色斑点病毒中的应用。