[发明专利]长期保存牡蛎样品中脂溶性贝类毒素的检测方法

权利要求书

1.长期保存牡蛎样品中脂溶性贝类毒素的检测方法，包括如下步骤：

(1)待测样品预处理；

(2)提取样品游离脂肪酸；

(3)游离脂肪酸三氟化硼甲酯化后气相色谱检测；

(4)结果校正。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤(4)结果校正根据公式i～iv进行：

(a/4+83.8/6000)*20＝(a/4+103.27/6000)*X_m i

(a/4+83.8/6000)*20＝(a/4+111.10/6000)*X_n ii

(a/4+83.8/6000)*20＝(a/4+111.99/6000)*X_p iii

(a/4+83.8/6000)*20＝(a/4+144.47/6000)*X_q iv

其中a是原始采集牡蛎样品中脂溶性贝类毒素的含量，X_m、X_n、X_p和X_q分别为保存第m、n、p、q天的样品取样量，其中m、n、p、q各自独立地地选自0～8的整数。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的m、n、p、q分别是1、3、5、7。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤(1)是：将保存的去壳牡蛎样品至于室温下使冷冻样品融化呈半冷冻状态，除去牡蛎外部附着的冰片，并用吸水纸吸除表面水分后，用绞碎机打碎并称量备用。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的保存的牡蛎样品的保存温度是0～4℃、-10℃或-20℃。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)包括如下步骤：

2A.提取样品总脂肪

取牡蛎碎肉样品10g，于100mL离心管中，加入二氯甲烷和甲醇按照体积比2:1的混合溶液50mL以及丁羟甲苯10ul，然后均质匀浆1min、4000r/min条件下离心5min；取出离心管后，取下层溶液于50mL具塞试管中，加入5mL 的0.88％KCl溶液后轻轻震荡混匀，混匀过程中不断开盖放气；过夜分层后取下层液体到250mL圆底烧瓶中进行减压浓缩真空干燥，得粘稠状油状物，即为样品总脂肪粗品；

2B.提取游离脂肪酸

①Amberlyst-26阴离子交换树脂的活化：

称取5g A-26树脂，加入50mL浓度为0.5mol/L的NaOH溶液，用恒温震荡器以60r/min振摇30min，倒掉NaOH液，用高纯水洗树脂3次，每次皆用10mL高纯水并振摇20min，用30mL甲醇洗3次，每次皆用10mL甲醇且振摇20min，重复上述甲醇洗树脂一次，将A-26树脂保存于甲醇中。

②提取游离脂肪酸

经过减压浓缩得到总脂肪后，在圆底烧瓶中加入15mL丙酮和甲醇按照体积比2:1的混合溶液以及250mg Amberlyst-A26阴离子交换树脂，置于恒温振荡器中，以水平60r/min震荡2h后去除溶液，用丙酮-甲醇溶液洗5次，最后在旋转蒸发仪在常温下以低于50r/min的转速吹干，即得样品中的游离脂肪酸。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤(3)包括如下步骤：

3A.游离脂肪酸的三氟化硼甲酯化

在圆底回流瓶中加入5mL 0.5mol/L的氢氧化钠-甲醇溶液混匀后连接回流装置。在100℃水浴中加热回流6～8min，然后加3mL三氟化硼-10％甲醇溶液反应5min，取出冷凝装置将回流瓶冷却至室温后加入2mL正己烷，将液体转入15mL离心管中，后用3mL饱和氯化钠溶液清洗平底烧瓶三次，合并饱和氯化钠溶液于15mL离心管，振摇后以4000r/min离心5min；吸取上层溶液约lmL于样品瓶中作为测试液，供气相色谱仪检测；

3B.气相色谱检测

气相毛细管色谱柱内壁涂有固定液100％二氰丙基聚硅氧烷，型号CNW CD-2560，100m×0.25mm i.d×0.2μm；

检测器：氢火焰离子化检测器；

检测器温度：280℃；

进样口温度：260℃；

气化室温度：250℃；

柱温箱温度：初始温度140℃，保持5min，以4℃/min升温至240℃，保持15min；

载气：N₂，载气流速1.0mL/min；分流比100∶1；

进样量1μL。