[发明专利]长期保存牡蛎样品中脂溶性贝类毒素的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物分析领域，涉及长期保存的复杂生物样品牡蛎中脂溶性贝类毒素的检测方法，尤其涉及检测结果中假阳性部分的校正方法。

背景技术

牡蛎味道鲜美，营养丰富，含有丰富的不饱和脂肪酸，如亚油酸、亚麻酸、二十二碳六烯酸等。但有实验研究发现不饱和游离脂肪酸并不是绝对安全的。早在1982日本学者Takagi T等使用游离脂肪酸标准品对小鼠进行腹腔注射，发现C20∶4n-6,C18∶3n-3,C20∶5n-3表现出高毒性,而C18∶2n-6,C22∶6n-3表现出低毒性，C18∶1n-9几乎无毒(Toxic effect of free polyenoic acids:a fat soluble marine toxin.Bull Fac Fish Hokkaido Univ 1982,33(4):255-262.)。之后Takagi T等进一步对不饱和游离脂肪酸的毒害作用进行研究，发现其中的多烯游离脂肪酸可能是小鼠生物法检测腹泻性贝毒假阳性结果的主要来源(Toxic effect of free unsaturated fatty acids in the mouse assay of diarrhetic shellfish toxin by intnperitoneal injection.Bull Jpn Soc Sci Fish 1984,50:1413-1418.)。

针对此问题，很多学者进行探索研究。唐倩囡等发现储藏温度和时间等因素会引起贝类肠腺产生某种生化物质，最终导致小白鼠死亡出现假阳性结果，从而影响小鼠法检测贝毒的结果(贝类低温储存后对腹泻性贝毒检疫的影响[J].湖北农业科学,2009,07:1722-1723.)。沈志刚采用1％硫酸-甲醇甲酯化脂肪酸方法和聚乙二醇(PEG)涂层的毛细管色谱柱对阴性牡蛎样品中游离脂肪酸进行研究，并对其随储存时间和储存温度含量变化进行监测分析，发现当-10℃冷冻保存四个月C20∶5n-3含量为389.0mg/kg，相当于1ml中小鼠腹腔注射液含有7.78mg C20∶5n-3，可造成小鼠死亡(牡蛎产品腹泻性贝毒检测假阳性结果的产生原因及其控制措施[D].中国农业科学院,2009.)。由此可见，经过一定时期保存的牡蛎样品中可能产生呈检测阳性的毒素类物质，而这些物质是在保存过程中产生，即时的检测值不能反应留存样品原始真实的贝类毒素含量，导致回溯性研究无法获得准确的数据信息。

当前脂肪酸的检测，前处理的衍生化法主要有碱法甲酯化、硫酸甲醇甲酯化、三氟化硼甲酯化。碱法甲酯化只适合于脂肪；硫酸-甲醇甲酯化既适于游离脂肪酸，又适合于结合态脂肪酸(脂肪)，但是容易造成长链脂肪酸(碳链长度大于20个碳原子)的损失。三氟化硼法能利用快速皂化使脂肪酸盐直接转化成脂肪酸甲酯，减少酸化提取手续，并可防止常规法皂化时所引起的异构化。

本发明即拟深入研究采用三氟化硼甲酯化方法对留存牡蛎样品中脂溶性贝类毒素进行校正性检测的方法，以提供一种可以通过检测留存贝类样品中贝类毒素含量来获得原产样品中毒素准确含量的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够校正检测阳性错误的应用于长期保存牡蛎样品中脂溶性贝类毒素的检测方法，所述方法包括如下步骤：

(1)待测样品预处理；

(2)提取样品游离脂肪酸；

(3)游离脂肪酸三氟化硼甲酯化后气相色谱检测；

(4)结果校正。

所述检测方法中，步骤(4)结果校正根据公式i～iv进行：

(a/4+83.8/6000)*20＝(a/4+103.27/6000)*X_m i

(a/4+83.8/6000)*20＝(a/4+111.10/6000)*X_n ii

(a/4+83.8/6000)*20＝(a/4+111.99/6000)*X_p iii

(a/4+83.8/6000)*20＝(a/4+144.47/6000)*X_q iv

其中a是原始采集牡蛎样品中脂溶性贝类毒素的含量，X_m、X_n、X_p和X_q分别为保存第m、n、p、q天的样品取样量，其中m、n、p、q各自独立地地选自0～8的整数。其中所述的m、n、p、q优选分别是1、3、5、7。