[发明专利]一种预防人或动物弓形虫病的DNA疫苗

说明书

本发明公开了一种预防人或动物弓形虫病的DNA疫苗，通过PCR扩增ROP19基因，将其插入真核表达载体pEGFP‑C1中构建重组质粒pEGFP‑C1‑ROP19(pROP19)，提取含目的基因的重组质粒获得弓形虫ROP19DNA疫苗。本发明采用DNA疫苗对BALB/c小鼠进行主动免疫后，通过测定免疫鼠的细胞和体液免疫指标来评价疫苗的免疫原性，通过计数小鼠弓形虫攻击实验后大脑中包囊的数量以及小鼠存活率来评估疫苗的免疫保护性。本发明可有效地增强体液免疫和细胞免疫反应，有效地降低免疫小鼠在接受弓形虫PRU株(II型)攻击后大脑包囊的形成率，以及延长弓形虫RH株(I型)攻击后小鼠的存活时间。

技术领域

本发明涉及一种疫苗，特别涉及一种基于弓形虫棒状体蛋白19(ROP19)的复合抗原表位，通过构建含有目的基因的重组质粒而获取的弓形虫疫苗，用于人或动物弓形虫病的预防。

背景技术

弓形虫(Toxoplasma gondii)是世界性分布的寄生原虫，广泛寄生于人体及动物的有核细胞内，引起严重的人兽共患病。弓形虫感染孕早期妇女可导致流产、早产甚至死产，亦可通过胎盘引起新生儿畸形和胎儿眼部并发症。对于免疫力缺乏或者低下的人群(如艾滋病和肿瘤患者)，弓形虫可导致严重的临床症状(如弓形虫脑病)甚至死亡。在免疫功能正常的宿主体内，弓形虫往往形成慢性感染，引起不可逆的中枢神经系统和视力的损害。作为一种机会致病性胞内寄生的原虫，弓形虫在宿主体内主要引起细胞免疫反应，是通过识别抗原蛋白的十几个氨基酸序列发挥作用，这就是抗原表位。表位分为T细胞表位和B细胞表位。T细胞表位在细胞内由主要组织相容性复合体(major histocompatibilitycomplex,MHC)I或II分子识别并递呈到细胞表面，然后分别被CD8⁺细胞毒T细胞的TCR识别和辅助性CD4⁺T细胞的TCR识别。B细胞表位则直接被B细胞受体BCR识别。有效的抗弓形虫病的疫苗主要产生保护性的Th1型细胞免疫反应，而除了CD8⁺T细胞表位之外，混合CD4⁺T细胞表位及B细胞表位可有效增强Th1型细胞免疫反应。因此研制针对弓形虫同时具有人类及BALB/c小鼠MHC分子限制性T细胞表位和B细胞表位的新疫苗是非常迫切和必要的。

弓形虫的棒状体蛋白(rhoptry protein，ROP)由前端的分泌器官棒状体分泌，在细胞入侵时发挥着主导作用，尤其与纳虫泡的形成关系密切。ROP的结构形态为棒状，故称之为棒体状蛋白，棒状体蛋白种类繁多，结构各异，具有各种各样的功能。其中已有部分关于ROP家族成员疫苗研究的报道，主要包括ROP1和ROP2家族，目前已证实可作为疫苗候选基因的ROP2家族成员包括ROP2、ROP4、ROP5、ROP8、ROP13、ROP16、ROP17和ROP18，每种棒状蛋白的氨基酸序列和具体的结构单元不同，导致其免疫原理不同，同时免疫保护效果不同。

发表在SCI收录期刊Parasitology International上“Immune response inducedby recombinant Mycobacterium bovis BCG expressing ROP2gene of Toxoplasmagondii”文章公开报道有关ROP2DNA疫苗研究报道，然而ROP2DNA疫苗的免疫保护效果并不能达到令人满意的程度。另外上述的其他ROP蛋白制备成为的疫苗并没有同时抗RH株弓形虫(I型株)和PRU株弓形虫(II型株)的优异性能。

ROP家族成员之一的ROP19蛋白，主要定位于弓形虫棒状体和纳虫空泡，目前对于ROP的研究报道较少，而且并没有ROP19蛋白在制备预防人或动物弓形虫病的DNA疫苗的相关报道。

发明内容