[发明专利]一种用微生物酶法合成苄基异硫氰酸酯的方法

说明书

本发明公开了一种用微生物酶法合成苄基异硫氰酸酯的方法。本发明所提供的方法包括如下步骤：将7种反应底物和6种蛋白配制成反应体系，反应后获得所述苄基异硫氰酸酯；所述7种反应底物分别为苯丙氨酸、半胱氨酸、腺嘌呤核苷三磷酸、还原型辅酶Ⅱ、尿苷二磷酸葡萄糖、3′‑磷酸腺苷‑5′‑磷酰硫酸和磷酸吡哆醛；所述6种蛋白分别为序列表中序列1、3、5、7、9和11所示的MA2R2蛋白、MB1R2蛋白、METC蛋白、UGT74B1蛋白、SOT18蛋白和BMYR蛋白。该方法是在现有的植物体内苄基异硫氰酸酯合成途径的基础上，进行改造后获得的。实验证明，该方法可以体外合成出苄基异硫氰酸酯。本发明为其他途径复杂的异硫氰酸酯在微生物中的合成奠定基础。

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一种用微生物酶法合成苄基异硫氰酸酯的方法。

背景技术

硫苷是一种含硫的阴离子亲水性植物次生代谢产物，几乎存在于所有的十字花科植物中。硫苷晶体的x射线分析证明:所有的硫苷都具有相同的基本结构，其化学结构通常由一个β-D-硫葡萄糖基、一个硫化肟基团以及一个来源于蛋氨酸、色氨酸或苯丙氨酸等8种氨基酸的可变侧链构成。然而硫苷自身并不具有生物活性，当植物受到外界刺激时硫苷-硫苷酶二元系统会被激活，硫苷在硫苷酶的作用下水解并经过一系列的分子重排形成异硫氰酸酯。异硫氰酸酯的生物活性主要体现在抑菌、抗虫害，近年来研究证明萝卜硫素(SFN)、苄基异硫氰酸酯(BITC)、苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)等具有很好的抗癌防癌作用。

异硫氰酸酯的前体物质-硫苷合成途径比较复杂，主要分为3部分：前体氨基酸侧链延伸；核心结构形成，次级侧链的修饰。其中核心结构形成是所有硫苷合成的共有步骤。由于苄基异硫氰酸酯的合成以苯丙氨酸为底物只经过核心结构形成这一模块，途径相对简单，可以为其他途径复杂的异硫氰酸酯在微生物中的合成奠定基础。

植物体内苄基异硫氰酸酯合成途径具体如下：苯丙氨酸由细胞色素P450家族蛋白CYP79A2催化生成苄基醛肟；再由该家族另外一个蛋白CYP83B1催化生成腈类氧化物，该产物为强亲电子产物立刻和谷胱甘肽发生反应生成S-烷基磺肟酸共轭物；C-S裂解酶(SUR1)进一步催化反应生成苄基硫肟酸、丙酮酸、NH3；葡糖转移酶(UGT74B1)将尿苷二磷酸葡萄糖苷(UDPG)上的葡萄糖基团转移到硫肟酸上形成苄基脱硫硫苷；脱硫硫苷硫酸化酶(SOT16)在3-氧-磷酸腺苷-5-磷硫酸(PAPS)参与下催化脱硫硫苷生成苄基硫苷。苄基硫苷在硫苷酶(MYR)的作用下生成苄基异硫氰酸酯(BITC)。目前有实验推测在植物体内第二步反应产物腈类氧化物在谷胱甘肽硫转移酶(GSTF)的作用和谷胱甘肽反应生成谷胱甘肽共轭物，在由γ-谷酰基蛋白酶(GGP1)作用下生成半胱氨酸-甘氨酸共轭物，该产物在被SUR1催化反应进入后续步骤。

植物次生代谢产物通常产量较低，分离纯化工艺复杂，产品纯度低，且纯化过程使用有机试剂会造成环境污染；植物生长周期长，成本高等弊端同样限制了异硫氰酸酯的规模化生产。微生物的生长周期短，成本低等，而且在微生物体内搭建单一植物次生代谢途径可以避免植物本身存在的其他次生代谢途径的竞争问题，实现单一产物的快速、大量表达。

发明内容

本发明的目的是提供一种用微生物酶法合成苄基异硫氰酸酯的方法。

本发明所提供的用微生物酶法合成苄基异硫氰酸酯的方法，为体外合成法，具体可包括如下步骤：将7种反应底物和6种蛋白配制成反应体系，反应后获得所述苄基异硫氰酸酯；

所述7种反应底物分别为苯丙氨酸(phenylalanine)、半胱氨酸(Cysteine)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)、尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)、3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(PAPS)和磷酸吡哆醛(PLP)；