[发明专利]去除B8R和A47L的重组痘苗病毒及制备方法和应用

权利要求书

1.去除B8R和A47L的重组痘苗病毒，其特征在于，对痘苗病毒进行重 组改造，去除B8R和A47L，其中B8R和A47L的碱基序列分别见序列表1 和2。

2.去除B8R和A47L的重组痘苗病毒的制备方法，其特征在于，具体包 括如下步骤：

步骤1，构建质粒pB8R-OVA和pA47L-EGFP；

步骤2，将质粒pB8R-OVA在CV-1细胞中与野生型痘苗病毒重组，获 得中间产物重组病毒VACV-ΔB8R-OVA；然后质粒pA47L-EGFP在CV-1细 胞中与VACV-ΔB8R-OVA病毒重组，获得终产物重组痘苗病毒 VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP；

步骤3，筛选纯化重组痘苗病毒VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP。

3.根据权利要求2所述的去除B8R和A47L的重组痘苗病毒的制备方法， 其特征在于，步骤1的具体步骤如下：

S11、取冻存的野生型痘苗病毒VACV-WR和VACV-OVA病毒，使用 Biomiga病毒基因组提取试剂盒，提取基因组DNA；

S12、根据OVA基因序列，设计引物，以VACV-OVA病毒基因组为模 板，PCR获得OVA基因片段；根据野生型痘苗病毒的B8R基因及其侧翼序 列，设计引物，以VACV-WR病毒基因组为模板，PCR获得B8R基因的左 右臂同源序列B8RL和B8RR；通过酶切连接将获得的OVA基因插入pSC11 质粒的P7.5启动子后，得到质粒pSC11-OVA，然后将B8RL和B8RR分别 克隆替换质粒的TKL和TKR，得到重组质粒pB8R-OVA；

S13、利用EGFP引物EGFP-F1和EGFP-R1从质粒pEGFP-N1中获得 EGFP基因片段；根据VACV-WR的A47L基因及其上下游序列，设计引物， 以VACV-WR基因组DNA为模板，PCR获得A47L基因的上下游同源序列 臂A47LL和A47LR；通过酶切连接将获得的EGFP基因替换pSC11质粒中 的LacZ，连于P11启动子后，将获得的上下游同源臂A47LL和A47LR通 过酶切连接的方法分别替代质粒的TKL和TKR，获得重组质粒 pA47L-EGFP。