[发明专利]去除B8R和A47L的重组痘苗病毒及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程及生物技术药物领域，具体涉及一种去除B8R 和A47L的重组痘苗病毒，本发明还涉及该重组痘苗病毒的制备方法和应用。

背景技术

基因重组技术的发展为疫苗的研发提供了一个有效的手段。以活病毒为 载体，插入外源性目的基因的重组疫苗(recombinantvaccine)，占到为数众 多的基因治疗研究的70％以上。

天花是迄今为止人类利用疫苗这一免疫手段成功根除的唯一一种感染 性疾病。痘苗病毒(vacciniavirus)作为人类预防天花的疫苗，在根除天花 中发挥了重要的作用。

痘苗病毒是一类病毒粒最大的双链DNA病毒，与天花病毒同属痘病毒 科正痘病毒属(Poxvirus)。由于在天花免疫预防中的成功应用，痘苗病毒被 当做衡量一个疫苗有效与否的“金标准”。痘苗病毒被广泛应用于人类长达一 个多世纪，在人体的安全性和有效性已得到充分的证明。因而，痘苗病毒是 最早被用做疫苗载体的病毒。由于在消除天花中的成功应用，痘苗病毒被认 为是疫苗和其他生物治疗药物的理想载体。痘苗病毒作为疫苗及生物技术药 物的载体，与其他载体(如逆转录病毒、人单纯疱疹病毒、腺病毒、及某些 细菌)相比较，具有独特优势，包括：1)载体基因组大，可插入较大的外 源基因而不改变其生物学特性和感染性；2)重组病毒构建相对简单，易于 构建多价疫苗；3)依靠自身启动子，能够高效表达外源蛋白，有效地加工 表达产物，刺激机体产生良好的免疫反应；4)接种方便；5)易于生产；6) 冻干保存效价稳定。

目前国际上有多家生物公司和研究小组进行以痘苗病毒为载体的疫苗 和其他生物技术药物的研发，基本技术方案均为去除痘苗病毒不同区段的基 因(如TK)，并插入外源目的基因。上述产品有些已经进入II期临床。国内 也有研究小组进行上述工作，但为数不多。痘苗病毒作为疫苗或药物的载体， 一个显著的问题是痘苗病毒自身具有较强的免疫优势，使得外源性抗原的表 达和免疫原性较弱。而目前以活痘苗病毒为载体的疫苗和生物技术药物均未 对载体的免疫优势进行削弱，极大地制约了疫苗的有效性。另一方面，虽然 痘苗病毒作为疫苗在大量人群中长期使用，其安全性得到了充分的肯定，但 是痘苗病毒接种后仍会在少数个体中产生一些不良反应，尤其在一些免疫功 能低下的特定人群中更易出现，包括局部甚至全身性疱疹，及较为罕见的神 经系统症状。目前国内外与本发明相似的现有技术方案均未考虑提高痘苗病 毒的安全性。

研究表明B8R和A47L均为痘苗病毒免疫优势最强的抗原表位之一，去 除B8R和A47L可显著降低痘苗病毒自身的免疫优势，从而提高外源性目的 抗原的免疫原性。同时，B8R基因编码蛋白是一种干扰素γ(IFN-γ)的特 异性受体，IFN-γ作为重要的免疫诱导和调节因子在一系列免疫应答中发挥 重要的作用；B8R的缺失可降低痘苗病毒的毒力，并对机体的抗病毒免疫造 成影响。A47L是痘苗病毒上的一种重要的激活杀伤性T细胞的抗原表位， 在痘苗病毒感染中高转录高表达，在正痘病毒中高度保守，而在其他非正痘 病毒中缺乏相似序列。研究未发现B8R和A47L具备痘苗病毒生长和复制过 程中所必需的功能，去除B8R和A47L对痘苗病毒的感染复制等自身生物学 特性无影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种去除B8R和A47L的重组痘苗病毒，解决了现 有以活痘苗病毒为载体的疫苗和生物技术药物均未对载体的免疫优势进行 削弱，极大地制约了疫苗的有效性的问题，且提高了痘苗病毒的安全性。

本发明的第二个目的是提供一种去除B8R和A47L的重组痘苗病毒的制 备方法。

本发明的第三个目的是提供一种去除B8R和A47L的重组痘苗病毒的应 用。

本发明所采用的技术方案是，去除B8R和A47L的重组痘苗病毒，对痘 苗病毒进行重组改造，去除B8R和A47L，其中B8R和A47L的碱基序列分 别见序列表1和2。

本发明所采用的第二个技术方案是：去除B8R和A47L的重组痘苗病毒 的制备方法，具体包括如下步骤：

步骤1，构建质粒pB8R-OVA和pA47L-EGFP；