[发明专利]一种牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法

权利要求书

1.一种牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法，其特征在于：

1）取洗涤后样品经过量浓度为4% PFA溶液固定；固定后用100%甲醇溶液于-20℃保存，将上述固定后保存样品经处理作为原位杂交样品；

2）上述原位杂交样品进行复水、洗涤、蛋白酶K消化、固定而后经洗涤、预杂交，预杂交后与含有牙鲆RNA探针的杂交液混合于50-70℃下杂交过夜；杂交处理后洗涤，并经抗体孵育，再洗涤，避光显色，终止显色，再固定，再洗涤， 20-30%蔗糖沉降；

3）上述沉降样品经OCT包埋后进行冰冻切片，进而实现对牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的标记；

步骤1）中样品为根据幼鱼全长不同分别取样，幼鱼全长<60.0 mm的取其整个腹部；幼鱼全长>60.0 mm直接剥离性腺，取样后无RNA酶的PBS缓冲液漂洗，待用；

步骤1）中固定后保存样品经处理为腹部样品去除多余内脏；

或，性腺样品的系膜剥离去除、将性腺样品切成约5mm。

2.按权利要求1所述的牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法，其特征在于：将原位杂交样品依次经体积比3：2和2：3的，浓度为100%甲醇和无RNA酶的1×PBST缓冲液分别进行复水处理10-30min，复水处理后用过量的无RNA酶的1×PBST缓冲液洗涤，洗涤后加入10μg/ml的蛋白酶K于37℃处理消化10-30 min，消化后经过量的4% PFA溶液再固定20-60min，再固定后经过量无RNA酶的1×PBST缓冲液洗涤，洗涤后样品在过量预杂交液中于50-70℃预杂交2-5h。

3.按权利要求2所述的牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法，其特征在于：所述预杂交液为50(v)%去离子甲酰胺，25(v)% 20×SSC，50μg/ml肝素，500μg/ml 酵母tRNA，0.1(v)%Tween-20，1M 的柠檬酸460μl，加无RNA酶的水定容至50ml。

4.按权利要求1所述的牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法，其特征在于：所述含有牙鲆RNA探针的杂交液是将用预杂交液稀释RNA探针至终浓度为1-2ng/μl，再将其置于80℃变性30min，变性后，待用。

5.按权利要求1、3或4所述的牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法，其特征在于：所述预杂交后与含有牙鲆RNA探针的杂交液混合于50-70℃下杂交过夜，然后依次于50-70℃下用过量的体积比为1:1的不含肝素和酵母tRNA的预杂交液和2×SSC的混合液洗涤30-60min，洗涤后用过量2×SSC洗涤30-60min，再用含0.1% CHAPS 的0.2×SSC洗涤两次，每次30-60min；最后在室温下用MAB溶液洗涤5-10 min。

6.按权利要求1所述的牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法，其特征在于：所述杂交处理洗涤后样品用封闭液于室温下水平摇床封闭2-4h，而后加入碱性磷酸酶抗体在4℃孵育过夜，再洗涤，避光显色，终止显色，再固定，再洗涤，20-30%蔗糖沉降。

7.按权利要求6所述的牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法，其特征在于：所述封闭液为含10%羊血清、2%封闭剂的1×MAB。