[发明专利]一种牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法

说明书

本发明涉及幼鱼性腺mRNA原位杂交技术，具体的说是一种牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法。取洗涤后样品经过量浓度为4％PFA溶液固定；固定后用100％甲醇溶液于‑20℃保存，将上述固定后保存样品经处理作为原位杂交样品；上述原位杂交样品进行复水、洗涤、蛋白酶K消化、固定而后经洗涤、预杂交，预杂交后与含有牙鲆RNA探针的杂交液混合于50‑70℃下杂交过夜；杂交处理后洗涤，并经抗体孵育，再洗涤，避光显色，终止显色，再固定，再洗涤，20‑30％蔗糖沉降；上述沉降样品经OCT包埋后进行冰冻切片，进而实现对牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的标记。本发明的实施能够清晰地描述牙鲆相关基因在性腺中的定位(mRNA水平)，取得了突破性的进展。

技术领域

本发明涉及幼鱼性腺mRNA原位杂交技术，具体的说是一种牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法。

背景技术

牙鲆，俗称牙片，为鲆鲽鱼类，录属于鲽形目、牙鲆科、牙鲆属，是我国和日韩等国的重要海水养殖鱼类。牙鲆具有雄鱼比雌鱼生长快、个体大的特点，牙鲆已逐步在性别决定与分化研究领域成为海水经济鱼类模式物种，研究其性别决定与分化的机制，确定性别决定与分化相关的基因，并以此为基础，对其实施性别控制，具有重要的理论和实践意义。通过牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交可以解析性别决定和分化相关基因的表达模式及相互关系，但是牙鲆幼鱼早期性腺较小、分离困难，而性腺组织较大时期难以直接进行性腺原位杂交，使得该技术难以应用。因此建立牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法，对于牙鲆性别决定和分化相关规律的阐述具有重要的意义；另外本发明在其它鱼类幼鱼性腺等组织的原位杂交进行基因定位和功能研究方面将有一定应用前景，甚至可以开发相关检测试剂盒而进行产业化生产。

发明内容

本发明在于提供一种牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法。

为实现上述目的本发明采用的技术方案为：

一种牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法：

1)取洗涤后样品经过量浓度为4％PFA溶液固定；固定后用100％甲醇溶液于-20℃保存，将上述固定后保存样品经处理作为原位杂交样品；

2)上述原位杂交样品进行复水、洗涤、蛋白酶K消化、固定而后经洗涤、预杂交，预杂交后与含有牙鲆RNA探针的杂交液混合于50-70℃下杂交过夜；杂交处理后洗涤，并经抗体孵育，再洗涤，避光显色，终止显色，再固定，再洗涤，20-30％蔗糖沉降；

3)上述沉降样品经OCT包埋后进行冰冻切片，进而实现对牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的标记。

所述样品为根据幼鱼全长不同分别取样，幼鱼全长<60.0mm的取其整个腹部；幼鱼全长>60.0mm直接剥离性腺，取样后无RNA酶的PBS缓冲液漂洗，待用。

所述经固定后保存的腹部样品去除多余内脏；经固定后保存的性腺样品的系膜剥离去除、将性腺切成约5mm。

具体待做原位杂交前，将上述固定后保存样品进行进一步处理(腹部样品尽量去除多余内脏，性腺样品的系膜剥离去除、将性腺切成5mm左右大小)，以获得原位杂交样品；

将原位杂交样品依次经体积比3：2和2：3的，浓度为100％甲醇和无RNA酶的1×PBST缓冲液分别进行复水处理10-30min，复水处理后用过量的无RNA酶的1×PBST缓冲液洗涤，洗涤后加入蛋白酶K(10μg/ml)于37℃处理消化10-30min，消化后经过量的4％PFA溶液再固定20-60min，再固定后经过量无RNA酶的1×PBST缓冲液洗涤，洗涤后样品在过量预杂交液中于50-70℃预杂交2-5h。

所述无RNA酶的1×PBST缓冲液成分为：136.89mM NaCl，2.67mM KCl，8.24mMNa2HPO4，1.76mM KH2PO4，0.1(v)％Tween-20，由无RNA酶水配置，PH7.4。