[发明专利]一种防治禽流感H5N1的重组杆状病毒疫苗的制备方法

说明书

本发明涉及一种防治禽流感H5N1的重组杆状病毒疫苗的制备方法，具体涉及一种表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组H5N1病毒疫苗株及其制备方法，具体包含以下步骤：1)pS‑ITRs‑HA质粒的构建，2)pS‑ITRs‑HA质粒转化E.coli DH10 Bac，3)重组杆状病毒穿梭载体转染Sf9昆虫细胞，4)重组杆状病毒的扩增。制备获得的重组H5N1病毒疫苗株对免疫鸡的血清进行免疫检测，免疫鸡血清中IgG抗体的水平最高可达0.966，IL‑2、IL‑4和IFN‑γ的浓度最高可分别达到89.67ng/L、80.21ng/L和64.24ng/L，以上结果表明重组杆状病毒疫苗可有效的刺激鸡体同时产生体液免疫和细胞免疫，为鸡群提供了双重免疫保护作用，本发明为基于杆状病毒的禽流感疫苗的研发奠定理论基础。

技术领域

本发明涉及一种疫苗的制备方法，具体涉及一种禽流感H5N1的重组杆状病毒疫苗的制备方法。

背景技术

禽流感病毒(Avian Influenza Virus)对禽类及人类的威胁日益加剧，禽流感的防制越来越重要。目前，禽流感的防治主要是疫苗免疫，然而，由于H5N1亚型高致病禽流感的血清型众多、易发生抗原的变异，传统疫苗不能提供有力的保护；核酸疫苗的应用存在免疫保护期不长，制备成本高，以及安全性等制约因素，未被广泛使用。杆状病毒由于具有在宿主细胞内不复制，安全性高，蛋白表达量高等优点被广泛应用于昆虫细胞及哺乳动物细胞的转导。在真核表达系统中，杆状病毒载体系统是目前研制亚单位苗的主要工具，它是以昆虫杆状病毒为外源基因载体的表达系统，形成的重组杆状病毒可直接作为禽类疫苗对家禽进行直接免疫，且重组杆状病毒疫苗兼有活疫苗和亚单位苗的特点。但是由于杆状病毒转导哺乳动物细胞的效率及基因表达水平偏低、外源基因持续表达的时间较短，限制了杆状病毒作为禽类疫苗的应用，因此，如何提高杆状病毒的转导效率、外源基因表达效率和延长外源基因的表达时间成为研究热点。

血凝素HA作为禽流感病毒的主要保护性抗原，在其抗原性和致病性中发挥重要的作用。将H5N1型禽流感病毒HA基因克隆到由CMV启动的含有VSV-GED、WPRE、ITRs等调控元件的两组杆状病毒转移载体中，通过Bac-to-Bac系统获得重组Bacmid DNA；通过对Sf9昆虫细胞的转染，收获重组杆状病毒；利用重组杆状病毒进一步侵染鸡胚成纤维细胞，检测HA基因在禽类细胞中的表达水平；将携带HA基因的重组杆状病毒直接作为疫苗进行鸡体免疫试验，将目的抗原基因高效地传递到家禽细胞中，使其有效地刺激机体产生特异性保护抗体和较强的细胞免疫应答；分析重组杆状病毒的表达时间及免疫效果，为基于杆状病毒的禽流感疫苗的研发奠定基础。

发明内容

为了克服上述问题，本发明一方面提供了一种表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组H5N1病毒疫苗株，其保藏编号为CCTCC NO:V201606。

本发明的另一方面提供了一种表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组H5N1 病毒疫苗株，其中在病毒基因中插入包含禽流感病毒血凝素HA基因的基因片段，所述HA基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：1；优选还包含启动子CMV的核苷酸序列为SEQ ID NO：2、调控元件VSV-GED的核苷酸序列为SEQ ID NO：3、调控元件WPRE的核苷酸序列为SEQ ID NO：4和/或调控元件ITRs的核苷酸序列为SEQ ID NO：5。

本发明再一方面还提供了一种重组H5N1病毒疫苗，其中包含根据权利要求1或2所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组H5N1病毒疫苗株作为活性成分。

本发明还提供了一种前述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组H5N1病毒疫苗株的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

1)pS-ITRs-HA质粒的构建，

2)pS-ITRs-HA质粒转化E.coli DH10Bac，

3)重组杆状病毒穿梭载体转染Sf9昆虫细胞，

4)重组杆状病毒的扩增；