[发明专利]以miR-155前体为模板制备RNA探针的方法

说明书

技术领域

本发明属于核酸诊断领域，具体涉及一种以miR-155前体为模板制备RNA 探针的方法及其应用。

背景技术

荧光原位杂交技术(Fluorescenceinsituhybridization，FISH)是一种重要的 非放射性原位杂交技术，荧光染料标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA 或RNA分子杂交，如果被检测的染色体靶DNA与所用的核酸探针是同源互补 的，二者经变性-退火-复性，由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线 性排列，因而探针可以直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。 通过在荧光显微镜下观察荧光信号，以确定与特异探针杂交后结合了荧光探针的 DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位，对待测DNA进行定性、 定量或相对定位分析。

荧光原位杂交技术(FISH)具有很多优点，无需放射性同位素标记，安全 性较高；FISH的实验周期短，探针稳定性强；通过多次免疫化学反应，使其杂 交信号放大，提高灵敏度，检测的灵敏度接近同位素探针杂交；FISH的分辨率 高达3-20Mb；FISH可以用不同修饰核苷酸分子标记不同的探针，即可以制备成 多色探针。

FISH技术已经在基因定位、基因作图、基因扩增和缺失的检测、产前诊断、 哺乳动物染色体进化研究等领域得到了广泛应用，特别是在肿瘤诊断方面，FISH 技术被广泛用于乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤等实体瘤的早期诊断、疗效检测、 个体化治疗和预后判断等几个方面。cRNA探针比cDNA探针有更多的优势：避 免了双链cDNA探针在杂交反应中两条链之间易复性的可能性，提高了杂交反 应的敏感性；cRNA与RNA之间形成的杂交体比cDNA-RNA杂交体更稳定；且 cRNA-RNA之间形成的杂交体不受RNA酶的影响，因此杂交反应后可用RNA 酶处理，以除去未结合的探针，可降低本底信号的影响。

制备特异性强、灵敏度高和稳定性强的肿瘤检测探针，生产易保存和运输相 关试剂及试剂盒，对肿瘤早期诊断和治疗至关重要。研发出用于诊断和治疗多种 肿瘤的高品质探针及相关试剂盒，不仅能提高人民的健康水平，而且具有很大的 经济效益、社会效益及广阔的市场前景。

miRNA是内源性的非编码RNA分子，由长约18～25个核苷酸组成的单链 RNAs，呈高度保守性、时序表达特异性以及组织表达特异性，是参与肿瘤发生 和发展的重要致病因子，在实体恶性肿瘤以及血液系统肿瘤发病过程中起着重要 的作用。miRNAs具有肿瘤的抑癌基因与癌基因的双重作用，参与了生物体的发 育、增殖、分化和凋亡等方面的调控。miRNAs对其靶基因的转录后表达调节非 常重要，当miRNAs和靶向mRNA完全或几乎完全互补时，导致目的mRNA的 降解，当miRNAs和靶向mRNA不完全互补时，则负调控翻译过程，阻碍蛋白 质翻译。

胰腺癌是恶性程度比较高的消化系统疾病，其起病隐匿、早期发现困难，一 旦发现多属晚期，失去手术时机，能施行手术的患者只有15％-20％。目前，手 术切除是胰腺癌治疗的唯一根治疗法，但因其早期即可发生浸润和转移，导致胰 腺癌手术切除治愈率低。

胰腺癌肿瘤标记物的诊断则包括许多方面，如血清类肿瘤标记物、癌胚肿瘤 标志物、基因类肿瘤标志物及其他几十种胰腺癌相关基因和它们表达的蛋白质、 生长因子、黏附分子等。但上述标记物检测时均有不足之处，故需寻找更多的生 物标记，而近年来miRNA在胰腺癌诊断中的运用是人们关注的热点。胰腺癌的 早期诊断和早期治疗确实能提高胰腺癌患者的生存率。因此，制备出胰腺癌的早 期诊断相关miRNARNA检测探针至关重要。