[发明专利]一种检测单分子DNA复制的图像可视化方法

说明书

技术领域

本发明涉及纳米技术领域，具体地涉及一种检测单分子DNA复制的图像可视化方法。

背景技术

DNA复制主要是指以一条DNA单链为模版链，按照AT和CG配对原则，合成出另外一条DNA单链的过程。在体内，DNA复制非常重要，与生物体的发生，发展和演化等生命过程密切相关。在体外，也涉及到众多现代生物技术包括DNA测序、法医检验、纳米生物传感检测以及广泛采用的DNA扩增技术等。

DNA复制是一种生物分子反应过程，采用先进的荧光共振能量转移(FRET)技术和光镊技术，已经获得了诸多DNA复制反应的动态过程信息如DNA复制速度等。图像可视化的研究可获取分子事件过程的时间尺度和空间尺度上的数据，可为DNA复制的过程和机制研究提供可靠的信息。但在图像可视化方面，在单分子水平上，目前仅有针对RNA转录的图像可视化方法的有关报道，而对于单分子水平的DNA复制由于缺乏直接观察方法，以图像形式对DNA复制的动态过程进行描述和表征一直无法解决。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺少一种直接以图象形式对DNA复制的动态过程进行描述和表征的方法，提供了一种检测单分子DNA复制的图像可视化方法，本发明的方法将具有纳米级成像水平的原子力显微术(AFM)与新发展起来的纳米技术DNA折纸相结合，在单个分子水平上跟踪DNA的复制过程，记录单条DNA链与单个DNA聚合酶的相互结合、DNA链与DNA聚合酶间的移动，以及最终单链DNA链转变成双链DNA链的全过程。同时，还可捕捉衬底表面上DNA链各种各样的状态分布，以及DNA与DNA聚合酶相互作用时的变化情况，有助于理解生物分子行为作用机制，并可获取分子事件过程的时间尺度和空间尺度上的数据，为DNA复制的过程和机制研究提供可靠的信息。

本发明通过以下技术方案来解决上述技术问题：

本发明技术方案之一：一种检测单分子DNA复制的图象可视化方法，所述方法包括以下步骤：对含有dNTP、两端分别固定于空心DNA折纸上两个不同位置的单链DNA及结合所述单链DNA的DNA聚合酶Klenow片段的缓冲体系进行原子力显微镜扫描，通过所述原子力显微镜成像观察DNA的复制。

本发明中，所述空心DNA折纸可以为本领域常规的空心DNA折纸，包括各种不同形状的DNA折纸，如矩形或三角形空心DNA折纸，较佳地为中间空心的等边三角形，更佳地为内边长为30-50nm的中间空心的等边三角形，最佳地为内边长为40-50nm的中间空心的等边三角形，如内边长为50nm的中间空心的等边三角形。所述空心DNA折纸的图案可根据需要设计，只要图案的中间存在空隙能够容纳待同时可检测DNA链高度的距离以及DNA聚合酶即可。所述空心DNA折纸的制备方法可以为本领域常规的方法，较佳地由单链脚手架链DNA和订书钉单链DNA自组装形成，订书钉单链DNA用于固定脚手架链DNA形成目标图形，更佳地包括以下步骤：将单链脚手架链DNAM13mp18与A17与C33两条链分别替换为序列表SEQIDNO.1与SEQIDNO.2所示序列的订书钉链DNA集合ABCL混合于TAE-Mg²⁺缓冲体系，从95℃退火至20℃，退火速率为0.1℃/10s，其中，所述单链脚手架链M13mp18与所述A17与C33两条链分别替换为序列表SEQIDNO.1与SEQIDNO.2所示序列的订书钉链DNA集合ABCL的摩尔浓度比可以为本领域常规的比例，较佳地为1∶10。组装好的DNA折纸用40mMTris-乙酸、1mMEDTA、12.5mMMgCl₂，pH8.0缓冲液超滤。所述订书钉链DNA集合ABCL为所述订书钉链DNA集合ABCL为2010年3月17日发表在JAmChemSoc.第132卷第10期第3248-3249页的题为Goldnanoparticleself-similarchainstructureorganizedbyDNAorigami的论文的SupportinOnlineInformation中的S11-S16页所记载的从A01至Loop的DNA序列的集合，总共有208条序列，可自组装成等边三角形DNA折纸，作者为DingB，DengZ，YanH，CabriniS，ZuckermannRN，BokorJ，所述JAmChemSoc.为《美国化学学会期刊》。