[发明专利]促进人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及未分化细胞的培养，具体是一种促进人脐带间充质干细胞向 软骨细胞分化的方法。

背景技术

由于软骨细胞是终末分化细胞,自我修复的能力有限,因此,外伤或骨 关节炎等疾病所致的软骨缺损的治疗一直是骨科的难题。近年来,随着细胞 移植或软骨组织工程技术的发展,软骨缺损的治疗已取得了一定的进步。自 体软骨细胞移植是目前公认的治疗关节软骨缺损的较有效的方法。但自体软 骨细胞移植也有很多缺点:①自体软骨细胞来源困难。由于自体软骨细胞移 植时先要从关节的非负重区取一定大小的软骨块,因此它必然导致供区新的 缺损。②操作过程较繁琐,病人一定要承受两次手术的创伤。③软骨细胞 在体外扩增缓慢,容易发生去分化,即向成纤维细胞分化,从而使新生软骨 的性能不良。

间充质干细胞(mesenchymalstemcell,MSC)是目前备受关注的一类 具有高度自我更新和多向分化潜能的干细胞，可以分化为中胚层起源的多种 组织细胞，比如：成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。MSC的多潜能性和旁 分泌特性使其成为再生医学理想的候选细胞。近年来研究发现，MSC具有较 低的免疫原性，还具有抑制免疫细胞的作用，在诱导移植耐受方面发挥重要 作用。MSCs具有细胞来源丰富,损伤轻,可避免体内免疫排斥反应及根据不 同需要进行调控等优点,因此,MSCs是组织工程的重要种子细胞。

人脐带间充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells， hUCMSCs)具有来源丰富、对供者无影响、易于采集和运输、无异体排斥反应、 避免伦理争议等诸多优点，因此hUCMSCs有望成为间充质干细胞的理想来源。

牛磺酸(taurine，Tau)是一种含硫的氨基酸，化学名称为β氨基乙磺酸， 与其他氨基酸一样具有酸、碱两性电解质作用，易溶于水，化学性质比较稳 定。早在1827年，牛磺酸就已被人们发现，并成功从牛胆汁中分离获得，自 此国内外对牛磺酸进行了深入的研究，发现它具有广泛的生物学效应。在哺 乳动物组织中，蛋氨酸和半胱氨酸代谢的中间产物半胱亚磺酸经半胱亚磺酸 脱羧酶(CSAD)脱羧成亚牛磺酸，再氧化成牛磺酸。

牛磺酸广泛存在于动物体各组织器官内，是机体含量最丰富的游离氨基 酸之一。许多高等动物已失去了合成足够的牛磺酸以维持体内牛磺酸整体水 平的能力，需要从膳食中摄取。机体缺乏牛磺酸会引起许多疾病，如心肌病、 肾脏机能障碍等牛磺酸对机体的发育起着重要作用，并且牛磺酸对应激引起 的神经元损伤及其他病理疾病具有防护作用，牛磺酸具有细胞保护作用，并 能抑制细胞凋亡。以往的研究发现，敲除牛磺酸转运体(TauT)基因的小鼠 出现细胞变性，并且存在先天性线粒体缺陷、先天性心肌发育缺陷和先天 性骨骼肌发育缺陷，说明牛磺酸对正常发育起着十分重要的作用。

MSCs体外转化很大程度上依赖于培养条件,寻找合适的培养条件是诱 导MSCs向软骨细胞分化的关键。目前的MSCs分化成软骨细胞的方法所需的 周期都较长，并且诱导后Ⅱ型胶原的表达效率较低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种促使用安全，能够提高人脐带 间充质干细胞向软骨细胞分化的能力的促进人脐带间充质干细胞向软骨细胞 分化的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种促进人脐带间 充质干细胞向软骨细胞分化的方法，包括以下步骤：

(1)人脐带间充质干细胞的培养：将废弃的人脐带组织剪碎，用质量体 积比浓度0.1％的二型胶原酶消化成单个的细胞，离心；用间充质干细胞完全 培养液重悬细胞，过筛，收集细胞悬液，于37℃、体积分数为5％CO₂和95％ 空气、绝对湿度条件下进行培养，每隔1天换培养液，得高纯度的脐带间充 质干细胞；

(2)向软骨细胞诱导分化：将培养至第3代的脐带间充质干细胞收集并 离心，用间充质干细胞完全培养液重悬细胞接种到底面积为25cm²培养瓶中, 细胞完全铺满瓶底后，培养液更换为软骨细胞诱导液进行向软骨细胞的分化， 细胞分化第1天开始加入0.1-10mM牛磺酸，共培养16天即得分化的软骨细 胞。

所述步骤(2)中细胞分化第1天开始加入0.1-10mM牛磺酸，每星期换 液2次，共培养16天即得分化的软骨细胞。

优选，细胞分化第1天开始加入5mM牛磺酸。