[发明专利]一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法

权利要求书

1.一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，由如下步骤构成：

步骤一、CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计：

在NCBI上查询斑马鱼stat1a基因的基因组DNA序列及其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，设计一对stat1a基因的靶位点，靶点的选择遵循此标准：5’-GG-(N)18-NGG-3’；其中5’端的GG二核苷酸是T7启动子的一部分，靶位点的3’端是NGG；

步骤二、构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成

步骤三、斑马鱼胚胎的显微注射

在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中；

在进行显微注射之前，将Cas9mRNA和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9mRNA的终浓度为300ng/μL，gRNA的终浓度为20ng/μL；注射1.8nLCas9mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内；注射过的受精卵放置于5mmol/LNaCl，0.33mmol/LCaCl2，0.33mmol/LMgSO4，0.17mmol/LKCl的E3水中，28℃孵化；在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析；

步骤四、T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性

对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其stat1a基因是否存在突变，提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范；

步骤五、注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤；

步骤六、目的序列的TA克隆；

T7E1酶切初步鉴定有突变可能的目的序列再进行Sanger测序；若测序峰图有双峰，并且测序结果显示有插入或缺失现象的目的序列，接下来进行TA克隆之后挑取单克隆作进一步检测；

步骤七、质粒的Sanger测序

将双酶切检测结果显示条带大小符合预期结果的质粒送往测序，根据测序之后给出的峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比，根据比对结果，分析出每个单克隆的突变类型；

步骤八、获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代

通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，置于28℃培养，在初期观察F1代的存活率；受精两天后，每个突变体F1代分别取10个胚胎进行突变遗传性鉴定；将每个胚胎单独提取基因组，然后PCR扩增出700bp的靶位点附近区域，再进行T7E1酶切分析并送部分去测序，确定此突变是否可以遗传到F1代；

如果从F1代胚胎中检测到存在突变，则将斑马鱼突变体的F1代养大至2-3个月；再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾，筛选F1代突变体；

步骤九、获得斑马鱼突变体的F2代纯合子

从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代，放置于28℃培养，受精四天后取部分胚胎进行鉴定，将每个胚胎单独提取基因组，PCR扩增出700bp靶位点附近区域，通过BalⅠ限制性酶切分析并测序，初步检验是否可以得到stat1a突变体纯合子，如检验结果证明存在纯合子，则养大后再单条剪尾鉴定；

步骤十、依据步骤九方法进行该基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到这种新的斑马鱼品系；

所述步骤一中，引物序列为：

F1-靶位点a正向引物：

tgtaatacgactcactataggagaacgagtctctggccagttttagagctagaaatagc

F2-靶位点b正向引物：

tgtaatacgactcactatagacctctgacattccagcaagttttagagctagaaatagc

R-共用的反向引物：

Aagcaccgactcggtgccact。