[发明专利]一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法

说明书

一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法，由如下步骤构成：CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计：构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成；斑马鱼胚胎的显微注射；T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性；注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤；目的序列的TA克隆；质粒的Sanger测序；获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代；获得斑马鱼突变体的F2代纯合子依据上述方法进行该基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到这种新的斑马鱼品系。

技术领域

本发明属于基因敲除技术领域，涉及一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法。

背景技术

STAT1(signal transducer and activator of transcription 1)基因位于人类2q32.3，是编码750个氨基酸的转录因子。一般认为该基因介导干扰素信号通路，可直接调控靶基因的转录，并参与细胞增殖与分化等过程。通过基因差异表达谱分析和基因组关联分析等，发现STAT1基因与骨质疏松密切相关。

斑马鱼与人类在骨骼发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，且STAT1基因进化上较为保守，人类STAT1基因的两个不同剪接体STAT1-alpha和STAT1-beta对应于斑马鱼两个不同基因stat1a和stat1b，研究发现stat1a在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。而且，与其他动物模型相比，斑马鱼个体小、幼鱼通体透明，利于骨骼发育的观察。

通过CRISPR/Cas9基因打靶技术，在斑马鱼stat1a基因上设计合适的打靶位点，将体外合成的特异性sgRNA(终浓度20ng/μL)和Cas9-mRNA(终浓度300ng/μL)显微共注射进斑马鱼一细胞内，并通过活性检测证实了所选位点的有效性。

基因打靶技术起源于20世纪80年代末，是一种通过对基因组进行定点修饰来研究基因功能的重要的方法手段，也可用于治疗人类的各种遗传性疾病。该技术主要是利用缺失突变、基因灭活、染色体大片段删除以及外源基因导入等方式来改变生物的遗传信息，并且在生殖系中稳定遗传后表达突变性状，从而研究生物体内特定基因在生长发育过程中的作用，所以这类技术手段已成为现代分子生物学研究热点。传统的基因打靶技术是建立在胚胎干细胞(ESC)和同源重组技术的基础之上，故打靶技术效率极低。2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9，能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，但同时该技术存在一定的缺陷，其脱靶率相对较高。

基于此提供一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法，提高对statla基因的研究同时增加斑马鱼的商业价值就显得尤为必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法。本发明方法中，stat1基因涉及细胞的生长，分化、凋亡和免疫的基因表达。研究发现stat1a基因和骨骼的发育相关，本发明方法，可用于进行stat1a基因与骨骼发育的相关研究，也可进项其他方面探索研究，检测stat1a基因的缺失与其他器官的发育是否具有相关性，例如心脏等，具有很好的医学研究价值，同时敲除stat1a基因的斑马鱼其成长周期明显缩短，也具有很好的商业价值。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：

一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法由如下步骤构成：

步骤一、CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计：