[发明专利]提高植物转化效率的多个转化增强子序列的应用

说明书

发明背景

本申请要求获得于2006年7月19日提交的美国临时专利申请60/831,814的优先权，其公开通过引用全文结合到本文中。

1.发明领域

本发明主要涉及植物生物技术。更具体地说，本发明涉及提高细菌介导的植物转化效率的方法和组合物。

2.相关技术描述

在天然的农杆菌(Agrobacterium)介导的植物细胞的转化中，来自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒或者发根农杆菌(A.rhizogenes)的Ri质粒的一段DNA被转移到植物细胞中(例如Gelvin,2003)。该被转移的DNA(T-DNA)片段侧翼是不完全的24bp正向重复序列，该重复序列可被农杆菌核酸内切酶VirD2识别，通过在每一重复序列的一条链上的特定位点上形成切口而产生单链的T链。引发单链的T链形成的重复序列称为“右边界”(RB)，而终止单链的T链形成的重复序列被称为“左边界”(LB)。形成切口后，VirD2蛋白连附着在所述链的5’端，并引导T链进入植物细胞，在其他农杆菌和植物编码蛋白的帮助下T链被整合到植物基因组中。包含载体骨架序列在内的T-DNA区域的序列下游(从5’到3’方向)也可能被转移(例如Kononov等，1997)。这有可能是由于在转移到植物细胞之前农杆菌中至少一个边界不能形成缺口所致。

通过比较多种农杆菌菌株的RB和LB序列，表明RB和LB享有共同的基序(Canaday等,1992)，这表明可能有其他元件参与RB加工效率的调节。邻近RB的顺式作用序列存在于许多农杆菌菌株中，包括根瘤农杆菌和发根农杆菌。这些序列对野生型侵入性而言是必需的(Veluthambi等，1988；Shurvington和Ream1991；Toro等，1989；Toro等，1988；Hansen等，1992)。在根瘤农杆菌中该序列被Peralta等(1986)称为“超驱动(overdrive)”或者“T-DNA传递增强子”。在发根农杆菌中该序列被Hansen等(1992)称为“T-DNA转移激活序列(TSS)”。超驱动(“OD”)序列起始被定义为直接存在于章鱼碱TiTL-DNA的RB重复序列之前的特定24bp基序(Peralta等，1986)。类似的序列存在于章鱼碱TiTR-DNA的RB重复序列之前，并且也存在于胭脂碱TiRB和农杆碱RiTL右边界之前(Peralta等，1986、Shaw等，1984、Barker等，1983、Slighton等，1985)。进一步比较不同根瘤农杆菌显示8bp的超驱动核心序列存在于所有右边界序列之前，那些菌株包括胭脂碱菌株pTiT37、章鱼碱菌株pTiA6和发根农杆菌pRiA4(Peralta等，1986)。

章鱼碱超驱动序列的存在增强农杆菌细胞中单链T-DNA的形成，促进T-DNA转移到植物细胞中，并且对野生型侵入性是必需的(Peralta等，1986,Shurvinton和Ream1991)。当将pTiT37(产生胭脂碱的Ti质粒)RB近端的顺式作用序列放置在pTiT37的LB重复序列之前时，后者能够产生高效的单链T-DNA，这表明类似超驱动的序列确实也存在于胭脂碱Ti质粒上(Culianez-Macia和Hepburn1988,Peralta等，1986)，正如其在其他鉴定的(产生章鱼碱的)Ti质粒中一样。使异源的章鱼碱超驱动序列整合到胭脂碱pTiT37RB之前，导致比仅包含一个合成pTiT37RB重复序列的亲本菌株更大的侵入性(Peralta等，1986)。

VirC1蛋白结合到超驱动序列并且被认为可促进VirD2产生缺口(Toro等，1988,1989)，而virC突变导致了在植物中侵入性减弱(Close等，1987)和加工的单链T-DNA序列产量减少。根瘤农杆菌的章鱼碱和胭脂碱Ti质粒皆包含virC并且可以与virC突变反式互补以使减弱的侵入性恢复到野生型水平(Close等，1987)。

在发根农杆菌菌株8196、A4和2659中发现的TSS与根瘤农杆菌中的超驱动序列起着相似的作用。每一种发根农杆菌菌株具有不同但相关的序列(Hansen等，1992)。8bp的TSS核心序列在pRiA4重复5次、在pRi8196中重复6次而在pRi2659(Genbank登录号AJ271050)中重复17次(而不是Hansen等，1992中的16次)。除这些重复外pRiA4还具有保守的8bp超驱动核心序列。在pRiA4和pRi8196中更短的核心序列重复对于野生型侵入性而言是不足够的(Hansen等，1992)。