[发明专利]羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物及其应用

权利要求书

1.一种羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物，其特征在于：该底物为1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的芳香酯，其结构通式为：

其中，R为苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对丙基苯基、对硝基苯基、对氯苯基、2-呋喃基、2-噻吩基或4-乙氧基苯基取代基中的任意一种。

2.一种如权利要求1所述的羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物的应用，其特征在于：所述荧光探针底物在生理pH下可被羧酸酯酶2特异性催化并生成水解产物DDAO，该产物具有非常好的荧光发射属性，可采用荧光检测器实现产物的快速超灵敏检测；DDAO荧光检测条件为：激发波长600nm，在630～700nm进行荧光发射谱的检测；

该荧光探针底物可用作羧酸酯酶2活性快速定量检测，以及羧酸酯酶2抑制剂的快速筛选与评估。

3.按照权利要求2所述的羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物的应用，其特征在于羧酸酯酶2活性快速定量检测方法为：以DDAE水解反应作为羧酸酯酶2的特异性探针反应，CE2特异性催化DDAE并生成荧光产物DDAO，可通过定量检测单位时间内产物荧光强度的变化测定CE2的真实活性；其中所述DDAE为1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的芳香酯。

4.按照权利要求2所述的羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物的应用，其特征在于羧酸酯酶2抑制剂的快速筛选与评估方法为：以DDAE水解反应作为CE2的特异性探针反应，通过定量比较抑制剂存在与缺失状态下单位时间内水解产物DDAO的生成量评估该生物体系中CE2的残余活性，进而实现CE2抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价；其中所述DDAE为1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的芳香酯。

5.按照权利要求3所述的羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物的应用，其特征在于所述的羧酸酯酶2活性的快速定量检测方法，其特征在于羧酸酯酶2活性快速定量检测的具体步骤如下：

(1)使用常用磷酸盐缓冲液，反应温度为20～60℃之间；孵育体系pH介于7～10.5之间；

(2)以1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的芳香酯类衍生物作为特异性探针底物；底物浓度选择1/10～10K_m；

(3)反应时间为5～30分钟，在确保水解产物达到定量限且底物转化率在0.1～20％之间终止反应；

(4)定量测定单位时间内水解产物生成量代入标准曲线后换算获得CE2的活性及酶量。

6.按照权利要求4所述的羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物的应用，其特征在于所述羧酸酯酶2抑制剂筛选与评估的应用，其特征在于羧酸酯酶2抑制剂的筛选与评估方法具体步骤为：

(1)使用常用磷酸盐缓冲液，反应温度为20～60℃之间；孵育体系pH介于7～10.5之间；

(2)以1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的芳香酯类衍生物作为特异性探针底物；底物浓度选择1/10～10K_m；

(3)加入不同浓度的抑制剂并设置空白对照组，孵育5～30分钟，并在水解产物达到定量限且底物转化率在0.1～20％之间终止反应；

(4)定量测定单位时间内水解产物的荧光值并计算加入抑制剂组对荧光值减少的百分数作为抑制活性评估标准。

7.按照权利要求2～6中任意项所述羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物的应用，其特征在于：应用于重组表达的CE2酶、含有CE2的细胞及组织制备物生物样品中CE2活性的定量测定。