[发明专利]羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物及其应用

说明书

一种羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物及其应用。该特异性探针底物为1,3‑二氯‑7‑羟基‑9,9‑二甲基‑2(9H)‑吖啶酮(简称DDAO)的芳香酯(简称DDAE)。该底物可用于羧酸酯酶2(CE2)活性快速定量检测，以及羧酸酯酶2抑制剂与激活剂的快速筛选与评估。羧酸酯酶2活性快速定量检测流程如下：选择DDAE水解反应为探针反应，在含有羧酸酯酶2的缓冲液体系中加入适宜探针底物，在线性反应区间内通过定量检测单位时间内其水解代谢产物DDAO的生成量来测定各种体外生物样品中羧酸酯酶2酶的真实活性。该探针具有良好的选择性且水解产物DDAO的荧光发射波长(662nm)处于近红外区域，可显著减少生物样本自身背景荧光，提高灵敏度，具有良好的实用性和应用前景。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物及其应用。

背景技术

羧酸酯酶(Carboxylesterases，CE)是一种重要I相药物代谢酶，广泛分布于多种哺乳动物细胞中。该酶参与多种酯类药物、环境毒物及致癌物的解毒和代谢，能有效催化含羧酸酯键、酰胺键、硫酯键等外源性物质的水解。在人体中，羧酸酯酶主要包括羧酸酯酶1(CE1)和羧酸酯酶2(CE2)两个亚型，二者在组织分布和底物特异性上存在显著差异。CE2在人肠道和肿瘤组织中高表达，在提高很多前药的口服生物利用度中起着十分重要作用，并且其活性也会影响很多酯类抗癌试剂(如伊立替康和卡培他汀)的疗效。机体羧酸酯酶的组织分布与功能差异不仅决定其处置酯类外源物的能力，还与肥胖、动脉粥样硬化、高脂血症、高胆固醇血症、脂肪肝等代谢综合症发生发展密切相关。并且，羧酸酯酶2含量在结肠癌不同发病阶段具有显著差异，可作为结肠癌诊断的早期标志物。因此，精确测量不同生物体系中CE2的真实活性在临床上意义十分重大。

截至目前，CE2的定量方法有酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫印迹法(WesternBlotting)、质谱法和荧光法等。荧光检测方法由于高灵敏度、低侵袭性、快速和高通量等优点而备受欢迎，但是已有的荧光底物的发射波长都较短(λ_em＜630nm)，受生物基质自发荧光干扰较大，定量误差较大。而近红外荧光底物(λ_em＞650nm)可克服上述缺点，提高灵敏度。故而开发高选择性的人羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物具有非常广泛的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种羧酸酯酶2的荧光探针底物及其制备方法与应用，该探针底物的水解产物具有良好的荧光属性。利用该探针反应可对多种生物体系中CE2的分布和功能进行定量评价。

一种羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物，该底物为1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮(简称DDAO)的芳香酯(简称DDAE)，其结构通式为：

其中，R为苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对丙基苯基、对硝基苯基、对氯苯基、2-呋喃基、2-噻吩基或4-乙氧基苯基取代基中的任意一种。

一种羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物在生物检测中的应用，所述荧光探针底物可被羧酸酯酶2特异性催化并生成水解产物DDAO，该产物具有良好的荧光发射属性，可采用荧光检测器实现产物的快速超灵敏检测；DDAO荧光检测条件为：激发波长600nm，在630～700nm进行荧光发射谱的检测；该荧光探针底物可用作羧酸酯酶2活性快速定量检测，以及羧酸酯酶2抑制剂的快速筛选与评估。

羧酸酯酶2活性快速定量检测方法为：以DDAE水解反应作为CE2的特异性探针反应，CE2特异性催化DDAE并生成水解产物DDAO，该产物具有良好的荧光属性，可通过定量检测单位时间内荧光强度的变化测定CE2的真实活性。

羧酸酯酶2抑制剂的快速筛选与评估方法为：以DDAE水解反应作为CE2的特异性探针反应，通过定量比较抑制剂存在与缺失状态下单位时间内水解产物DDAO的生成量评估该生物体系中CE2的残余活性，进而实现CE2抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。