[发明专利]一种基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法

权利要求书

1.一种基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法，其特征在于，所述Primer3为Primer3开源PCR引物设计软件；所述方法包括：

S01：获取目标DNA序列的原始序列；所述获取目标DNA序列的原始序列包括：构建目标DNA序列的坐标文件，并使所述坐标文件的每一行包括一个基因组坐标；所述坐标文件形成所述目标DNA序列的原始序列；

S02：依据所述目标DNA序列的原始序列提取DNA多态性数据中的高频多态性位点；所述高频多态性位点包括单核苷酸高频多态性位点和插入缺失标记位点；

S03：对所述高频多态性位点进行标记；

S04：输出标记高频多态性位点的注释序列，所述注释序列和所述原始序列的碱基长度相同；

S05：读取所述注释序列，并计算解链温度和批量生成候选引物；

S06：筛选候选引物，得到引物。

2.根据权利要求1所述的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法，其特征在于，所述方法还包括：长目标片段的自动分割。

3.根据权利要求2所述的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法，其特征在于，所述长目标片段的自动分割包括：

若所述目标DNA序列的原始序列未获得候选引物，则将所述目标DNA序列的原始序列平均分为两个子序列，并分别设计引物；

若所述两个子序列未获得候选引物，则将所述两个子序列继续平分，直至所述目标DNA序列的原始序列有候选引物或所分得子序列的长度小于预设最低产物的长度。

4.根据权利要求2所述的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法，其特征在于，所述基因组坐标的形式为chrA:B+C形式，其中，chr为染色体命名前缀；A为染色体编号；B和C分别表示目标DNA序列在对应染色体上的起始坐标和结束坐标。

5.根据权利要求1所述的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法，其特征在于，步骤S02中所述提取DNA多态性数据中的高频多态性位点包括：从所述DNA多态性数据中提取与所述目标DNA序列的坐标文件相对应的高频多态性位点。

6.根据权利要求1所述的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法，其特征在于，步骤S03中所述对所述高频多态性位点进行标记包括：

以IUPAC标准简并码、“<>”和“[]”分别对所述高频多态性位点中的单核苷酸高频多态性位点、插入缺失标记位点和目标DNA序列进行标注。

7.根据权利要求6所述的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法，其特征在于，步骤S06中所述筛选候选引物包括：

筛除所述解链温度不在设定范围内的候选引物；

筛除单核苷酸高频多态性位点超过设定阈值的候选引物；

筛除3’端含有单核苷酸高频多态性位点的候选引物；

筛除3’端含有插入缺失标记位点的候选引物；

筛除3’端5个碱基范围内含有简并碱基的候选引物；

筛除非特异性扩增的候选引物；

筛除存在风险的候选引物。

8.根据权利要求7所述的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法，其特征在于，筛除非特异性扩增的候选引物为使用iPCRess软件和In-si licoPCR软件预测候选引物是否非特异性扩增，并将非特异性扩增的候选引物筛除。