[发明专利]一种基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法

说明书

本发明提供了一种基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法，所述方法包括：获取目标DNA序列的原始序列；提取DNA多态性数据中的高频多态性位点；对所述高频多态性位点进行标记；输出标记高频多态性位点的注释序列，所述注释序列和所述原始序列的碱基长度相同；读取所述注释序列，并生成候选引物；筛选候选引物等。本发明提供的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法能够回避高频多态性位点，减少因目标人群遗传多样性而导致的扩增失败；能够批量检测引物的特异性，减少非特异扩增、引物二聚体等原因导致的扩增失败；能够用于评估现有引物的特异性；能够对长目标片段进行自动分割。

技术领域

本发明涉及PCR引物设计技术领域，更为具体地说，涉及一种基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)作为最基础的分子生物学实验手段之一，能够在体外成百万倍地扩增目标DNA的拷贝数，因而被广泛应用于基因工程、诊断试剂等领域。

PCR实验成败的一个关键因素是PCR引物设计的好坏，因此，为设计出更好的引物，发明了种类众多的PCR引物设计软件。最早且最基础的PCR引物设计软件是Primer0.5，而后又在Primer0.5的基础上设计了现在被广泛使用的Primer3开源PCR引物设计软件。Primer3最基本的功能包括设计PCR引物和设计杂交探针，并且具有免费、开源、跨平台等优点。随后研究者在Primer3的基础上进行二次开发，形成了诸如NCBI Primer BLAST、BatchPrimer3等等衍生的引物设计软件，进一步扩展了Primer3的影响力。

虽然Primer3和其衍生软件得到了广泛应用，然而却仍不能完全满足实际项目中用户的个性化需求，存在很大的改进空间。Primer3及其衍生的引物设计软件存在如表1所示的问题：

表1：Primer3及其衍生的引物设计软件存在的问题

由上表能够看出，Primer3一次只能输入一个片段，无法批量操作；BatchPrimer3着重改进了批量操作，但是它不能预防遗传多样性或同源基因引起的扩增失败，也不能直接处理较长的目标序列；NCBI Primer BLAST主要通过BLAST技术(Basic Local AlignmentSearch Tool，BLAST)预测非特异扩增，但是它不支持批量操作；MPRIMER着重改进了非特异扩增预测和二级结构检测，但是同样不能直接处理较长的目标序列。

同时，引物设计领域还存在着众多商业软件，例如Primer Premier6.O，LIGO 7、Primer Analysis Software。尽管在人性化和易用度方面商业软件有明显优势，适合不熟悉生物信息学的实验人员使用；但是它们作为商业软件，源代码均不透明，无法自行开发扩展功能，也无法自行排除程序错误，难以和其他开源软件交互，跨平台状况不佳，并且还需要支付授权费。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法，以解决背景技术所述的现有PCR引物设计方法在设计PCR引物时因没有预防遗传多样性而导致引物设计失败的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法，所述方法包括：

S01：获取目标DNA序列的原始序列；

S02：依据所述目标DNA序列的原始序列提取DNA多态性数据中的高频多态性位点；

S03：对所述高频多态性位点进行标记；

S04：输出标记高频多态性位点的注释序列，所述注释序列和所述原始序列的碱基长度相同；