[发明专利]一种利用油桐下胚轴为外植体直接诱导植株再生的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种利用油桐下胚轴为外植体直 接诱导植株再生的方法。

背景技术

油桐(VerniciafordiiHemsley)为大戟科(Euphorbiaceae)油桐属(Vernicia)落 叶乔木，是我国特有的经济树种，与油茶、乌桕和核桃并称我国四大木本油料 植物。油桐是优良的生物能源树种，其种子含油率高达50％～70％，其中约94％ 为不饱和脂肪酸，是一种可替代石化柴油的优质干性油，具有广泛的应用前景。 我国生产的桐油品质优良，在国际上享有很高的声誉，出口产量和质量均居世 界第一，是国内、国际市场紧缺物资，国内外需求量大，一直供不应求。随着 生物质能源林业的快速发展，油桐的栽培前景十分广阔，市场需求量大，但缺 乏高效的种苗繁育技术，成为制约其产业化开发的瓶颈。目前在生产上，油桐 的繁育主要以种子实生苗和嫁接为主，育苗过程普遍存在繁殖效率低，繁殖过 程繁琐等问题，很难满足油桐规模推广的需求。利用组培快繁技术，可在短期 内获得大量的、遗传背景一致的油桐植株，以满足油桐规模化造林的需求；另 外，在此基础上对油桐品种进行遗传改良研究也迫在眉睫。

组织培养是快速繁殖优良植物品种的重要途径。目前，关于油桐的组织培 养方面的研究很少，主要以油桐离体叶片、下胚轴为外植体通过间接器官发生 途径获得植株再生和以叶柄为外植体通过直接器官发生途径获得植株再生，研 究过程均存在可重复性差的问题。目前有关以油桐无菌苗下胚轴为外植体通过 直接器官发生途径实现植株再生还未见报道。本试验以油桐无菌苗下胚轴为外 植体，通过不定芽的诱导、继代增殖、伸长、生根、驯化和移栽等过程，以期 建立了一个稳定的油桐离体再生体系，本发明培养周期短、培养程序简单且可 重复性好，为油桐快速繁殖以及后期的品种改良研究提供重要的技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用油桐下胚轴为外植 体直接诱导植株再生的方法。该方法利用油桐无菌苗幼嫩的下胚轴作为外植体 诱导不定芽，培养周期短，可重复性高，诱导不定芽健壮，生根率高，可避免 无性系变异的发生。同时还可应用与遗传转化，对油桐的转基因研究具有重要 意义。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种利用油桐下胚轴为 外植体直接诱导植株再生的方法，包括下述步骤：

步骤一、取当年生油桐成熟种子经初步消毒后，于超净工作台中进行表面 消毒；

步骤二、将步骤一消毒后的种子，取胚接种于萌发培养基中进行萌发；

步骤三、将萌发25～30d的无菌苗下胚轴切成适宜大小的切段，接种到不 定芽诱导培养基中，经过25～30d的光照培养,下胚轴的两端诱导出不定芽；

步骤四、将带有不定芽丛的下胚轴转接于增殖培养基中进行芽的增殖；

步骤五、培养15～20d后转至不定芽伸长培养基上进行芽的伸长培养；

步骤六、待芽长至2～4cm，转至生根培养基中进行生根；

步骤七、待幼苗长至2～4cm并带有2～4片真叶时，进行炼苗并移栽，获得健 壮的油桐植株再生。

作为上述方案的进一步改进，步骤一中的表面消毒是指选取优质的种子， 剥去种壳于流水下冲洗15～30min，期间添加2～4ml洗涤液。冲洗后，在超净台 用无菌水洗3次后在75％酒精中浸泡60～120s，再用0.1％HgCl₂处理3～6min，期 间不停晃动瓶子。然后用无菌水冲洗4～5次，充分洗掉残余的消毒液。消毒完 后，将种子放入无菌水中浸泡2～6h。

作为上述方案的进一步改进，步骤二中的油桐种子胚的获取是指将消毒后的 种子，用镊子和手术刀去除胚乳，获得完整的胚，并将胚进行萌发获得无菌苗。

作为上述方案的进一步改进，步骤三中的下胚轴适宜大小的切段是指将步 骤二中获得的无菌苗下胚轴切成0.3～0.6cm大小；所述的步骤三中的切段接种于 不定芽诱导培养基的方式为水平接种于不定芽诱导培养基中。

作为上述方案的进一步改进，步骤三中的不定芽诱导培养基为：MS+0.5～ 5.0mg/L6-BA+0.05～0.2mg/LIBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.8。