[发明专利]小鼠细小病毒定量PCR检测方法及其引物与探针

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，特别是涉及小鼠细小病毒的定量PCR检测，及其所用的引物和探 针。

背景技术

随着生物医药技术的飞速发展，人们越来越重视疫苗等生物制品的安全性，加强了对其 的质量控制。生物制品的质量控制不仅仅是对终产品的质量控制，还是对整个生产过程的质 量控制。因此，全球各国监管当局要求生产企业在临床试验被批准前及生物药和疫苗终产品 释放前，生产流程的各个环节都必须通过繁复的安全测试以证明产品的一致性、稳定性及纯 度。

啮齿类动物及衍生的传代细胞系CHO，广泛应用于生产疫苗和治疗性生物制品。CHO细胞 高度易感于小鼠细小病毒(MinuteVirusofMice，MVM)，MVM曾在日常生物药生产过程中 引起原液的污染。MVM基因组为单链线状DNA，约5.2kb，存在两个开放阅读框，一个编码 衣壳蛋白，另一个编码非结构(non-structure，NS)蛋白。MVM可以致先天性胎儿畸形，从 而导致流产。因此，提供一种合适的检测MVM的方法，从而拥有一个高效的细胞基质、原液 病毒感染的排除机制，变得非常必要。

目前常用的检测MVM方法有酶联免疫吸附试验方法、免疫酶试验方法和免疫荧光试验方 法，但这些方法都存在操作复杂、检测时间长、特异性和稳定性差等缺点。

定量PCR，又称定量即时聚合酶链锁反应(Quantitativerealtimepolymerasechain reaction)，是指用外标法(荧光杂交探针保证特异性)通过监测PCR过程(监测扩增效率) 达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种小鼠细小病毒的定量PCR检测方法，它简单， 高效，结果稳定，重复性好。

为解决上述技术问题，本发明的小鼠细小病毒的定量PCR检测方法，步骤包括：

1)提取待测样品DNA；

2)制备包含Mastermix、上下游引物、探针的PCR反应液；

3)梯度稀释标准品；

4)试剂的阴性对照、待测样品的阴性对照以及加入了标准品的待测样品上样；

5)PCR反应。

步骤1)，待测样品DNA模板的浓度为0.1μg/μL。

步骤3)，至少5个以上十倍梯度稀释标准品。标准品浓度范围一般为10～10⁵拷贝。

步骤5)，PCR反应体系为25微升，正反向引物的终浓度分别为100nM，探针的终浓度为 250nM。反应条件为：50℃2分钟；95℃10分钟；95℃15秒，60℃1分钟，45个循环。所 述正向引物具有如SEQIDNO.1所示的序列或其互补序列，所述反向引物具有如SEQIDNO.2 所示的序列或其互补序列，所述探针具有如SEQIDNO.3所示的序列或其互补序列。

本发明要解决的技术问题之二是提供一对用于上述小鼠细小病毒定量PCR检测方法的引 物对。所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物具有如SEQIDNO.1所示的序列 或其互补序列，所述反向引物具有如SEQIDNO.2所示的序列或其互补序列。

本发明要解决的技术问题之三是提供一条用于上述小鼠细小病毒定量PCR检测方法的探 针。所述探针具有如SEQIDNO.3所示的序列或其互补序列。

本发明采用TaqMan探针的定量PCR方法检测小鼠细小病毒，相比传统的MVM检测方法， 不仅具有更高的特异性和灵敏性，而且简单易操作，检测耗时短，结果稳定性和重复性好， 适合生物生产过程中各个阶段的MVM感染测试，例如动物来源的原辅料、原液和临床试验产 品批次，特别是原料测试中包含的主细胞库(Mastercellbank，MCB)、工作细胞库(Working cellbank，WCB)、最终生产细胞(EndofProduction，EPC)等等。

具体实施方式

为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合具体实施例，对本发明详 述如下：

本实施例的小鼠细小病毒的定量PCR检测方法，具体步骤为：