[发明专利]细胞膜微囊泡MVs和外泌体EXs的分离提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞膜微囊泡MVs和外泌体EXs的分离提取方法，属于医疗发明领域。

背景技术

细胞外囊泡(Extracellularvesicles,EVs)是细胞分泌释放的一类具有生物学活性的小囊泡。EVs可携带和传递母细胞的脂质，功能性蛋白质,信使RNAs(mRNAs)及微小RNAs(miRNAs)等物质进入靶细胞，调节靶细胞的基因表达和功能。由于技术水平和认识的限制，研究者最初提出EVs的概念时，仅仅把EVs当作是细胞的“垃圾袋”，让细胞摆脱一些无用蛋白垃圾。最近十多年的进一步研究发现，EVs所携带的“货物”具有重要的生物学意义，尤其是其所包含的miRNAs物质已经被证实会参与到疾病发生的过程。EVs可分为微泡(microvesicles,MVs)和外泌体(Exosomes,EXs)两大类。二者的主要区别在于生成方式的不同。MVs是当细胞激活，损伤或者凋亡后直接从细胞膜脱落的小囊泡，直径约为150nm-1000nm。EXs是由细胞内的多泡小体与细胞膜融合后以外泌的形式释放到细胞外，直径约为40nm-150nm。此外，研究者也提出二者发挥的生物作用也可能不同。但由于目前缺乏有效的分离方法把二者分离出来，对它们的特性和功能做出准确的分析受到极大的限制。

内皮祖细胞(EndothelialProgenitorCells,EPCs)和血管内皮细胞(EndothelialCells,ECs)是与血管系统直接相关的重要细胞，对于维持血管结构和功能的稳定，血管再生，组织修复和再生等具有重要的作用。已有研究证实，循环EPC水平下降和功能障碍与血管疾病的危险性高度相关。血管内皮细胞功能失调和损伤是导致血管病变的重要始动环节。临床研究发现，心血管疾病病人(包括动脉粥样硬化，脑卒中等)的循环内皮细胞(CirculatingEndothelialcells,cECs)源的EVs(cEC-EVs)水平显著增高，并与治疗效果及疾病预后相关。与之相反的是，循环内皮祖细胞(CirculatingEndothelialProgenitorCells,cEPCs)源的EVs(cEPC-EVs)在血管疾病病人中的水平显著增高降低。这些研究表明CEC-EVs和cEPC-EVs可作为潜在生物标记物用于疾病的预测，治疗效果的评估。最新研究发现EPC-EVs，通过携带某些与组织再生相关的蛋白，mRNAs及miRNAs进入靶细胞调节基因表达和细胞功能，从而促进血管形成、骨骼肌再生、神经再生、减少心肌损伤、保护急性肾小管损伤、减少肺损伤等。因此，它们在血管损伤修复与再生过程中可能发挥着关键的作用。可是，传统方法很难在复杂样本中分选和检测特异性EVs，例如cEC-EVs和cEPC-EVs。因此，这方面的研究发展受到极大地限制。

发明内容

本发明的目的提供一种细胞膜微囊泡MVs和外泌体EXs的分离提取方法，本发明分离和纯化高纯度的MVs和EXs，有利于对它们进行内容物的分析和功能的研究。高敏感和高特异性的检测有利于准确的评估其在疾病状态下的水平变化。进一步的产业化开发可研制出相关的试剂盒。

本发明的技术方案如下：

细胞膜微囊泡MVs和外泌体EXs的分离提取方法，其特征在于按以下步骤进行：

a、抽取外周血液样品3-10ml置于抗凝管保存；用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)稀释2－4倍，进行离心得到上清液血浆；b:对上清液血浆再次进行离心分离，沉淀物为MVs，c:对步骤b的上清液血浆进行超速离心分离，沉淀物为EXs。

用磷酸盐缓冲生理盐水PBS稀释3倍，混匀后用400r/s的转速离心，35分钟得到上清液血浆。

所述步骤b为：对上清液血浆再进行两次离心分离，第一次离心的转速2000r/s，20分钟，保存上清液进行第二次离心，第二次离心的转速20000r/s，120分钟，沉淀物为MVs。

所述步骤c为：对得到沉淀物为MVs的上清液血浆再进行离心分离，离心的转速169000r/s，6小时，离心后沉淀物为EXs。