[发明专利]一种鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法。

背景技术

对于病毒基因组测序，特别是RNA病毒的基因组测序，目前比较成熟，应用广泛的方法 是设计扩增不同序列区域的引物，分段扩增并克隆到载体上，使用载体通用引物或特异性引 物进行序列测定。最后结合5’/3’RACE技术，得到5’/3’两端的序列，将所有测序的序列拼接， 而获得病毒全基因组序列。

目前该方法在鸭甲型肝炎病毒(DHAV)的全基因组序列测定也得到广泛应用，但鸭甲 型肝炎病毒分为好多不同的基因型，比如基因1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)、基因2型鸭 甲型肝炎病毒(DHAV-2)、基因3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)等，按常规的策略，按每一 种基因型设计合成一套测序引物和5’/3’RACE引物，就需要3套，假如某些位点发生变异， 有可能导致测序失败，另外对于未知基因型鸭甲型肝炎病毒，还需要先进行鉴定，比较麻烦。

发明内容

本发明目的在于提供一种新的简便的鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法。本发明 设计了一套通用测序引物，通过用同一套引物就可以对不同基因型鸭甲型肝炎病毒DHAV-1、 DHAV-2及DHAV-3进行全基因测序列，即降低了分段克隆的劳动量，又节省了测序时间与 成本。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法，包括如下步骤：

(1)提取DHAVRNA，并通过反转录制备DHAVcDNA。

(2)DHAV基因组5’端和3’端的扩增：使用5’RACE试剂盒、引物5gps1out和5gps1in 按照试剂盒说明套式PCR扩增DHAV基因组5’端；使用3’RACE试剂盒、引物3GPS1-out 和3GPS1-in按照试剂盒说明套式PCR扩增DHAV基因组3’端，将扩增的DHAV基因组5’ 端和3’端进行胶回收纯化备用。

(3)DHAV基因组大片段的扩增：以DHAVcDNA为模板，分别使用引物对DHV3897A-F、 DHV3897A-R和DHV4867B-F、DHV4867B-R进行PCR扩增，分别得到3897bp和4867bp 左右产物，将两扩增产物进行胶回收纯化备用。

(4)将步骤(2)的扩增产物分别与T载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞，转化成功 的菌株送测序公司进行测序，测序引物为T载体测序引物。

将步骤(3)的扩增产物分别与T载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞，转化成功的菌株 送测序公司分别以引物对F1-F和F1-R、F2-F和F2-R、F3-F和F3-R、F4-F和F4-R、F5-F和 F5-R、F6-F和F6-R、F7-F和F7-R、F8-F、F8-R作为测序引物进行测序。

(5)以已知的DHAV全基因组序列为参考，将各测序片段进行组装。

上述各引物序列如下：

5gps1out：CAATATTTCAGCACCACCTCC；

5gps1in：GGCCAAGGGRTGGTWGGCTAA；

3GPS1-out：TGTGTTGGMTATGACATC；

3GPS1-in：TTGAGTTTYTGAAGAGAAC；

DHV3897A-F：TCCCRAMCCCCTTAATTCAACG，

DHV3897A-R：TCCAACTCATGCTRGTGGCATCT；

DHV4867B-F：CAGGCCCTATTWTRGTTGTTGG，

DHV4867B-R：GGGTGGGGRGGAATAGTAAAGTAAA；