[发明专利]一种麻雀防御素基因及表达产物

权利要求书

1.一种麻雀防御素基因SBD10，其特征在于，该基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1所示。

2.权利要求1编码的麻雀防御素蛋白序列如SEQIDNO:2所示。

3.权利要求1编码的，发挥抗菌功能的麻雀防御素成熟肽为SEQIDNO:3所示。

4.一种表达权利要求1中麻雀防御素的基因工程菌，其特征在于：由麻雀肾组织总RNA作为模板经两步法RT-PCR扩增得到麻雀防御素基因，经过密码子改造插入载体PET28a(+)中得到重组表达质粒PET28a-SBD10，转化大肠杆菌BL21得到的基因工程菌，菌株名称为大肠杆菌PET28a-SBD10/BL21,EscherichiacoliPET28a-SBD10/BL21,该基因工程菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M2016058。

5.制备权利要求4中表达麻雀防御素基因SBD10的基因工程菌的方法，包括引物设计，重组表达质粒构建和宿主菌株转化，其特征在于：

1)所述的引物设计是根据GenBank中收录的家禽防御素序列，选择其中的序列保守区段，用Primer5.0软件设计引物,

上游引物如SEQIDNO:4所示,下游引物如SEQIDNO:5所示；

2)所述的重组表达质粒构建是以麻雀肾脏组织总RNA作为模板，运用两步法RT-PCR扩增得到麻雀防御素基因SBD10，用Codon-adaptationtool软件对SBD10基因进行改造，去除优化基因中的信号肽，并在新基因片段两端设计BamHⅠ和HindⅢ酶切位点，人工合成改造后的基因，用BamHⅠ酶和HindⅢ酶双酶切，并将酶切产物连接到载体PET28a(+)的双酶切位点上得到重组表达质粒PET28a-SBD10；

3)所述的宿主菌株转化就是将重组表达质粒PET28a-SBD10转化到大肠杆菌BL21中，经抗性筛选和验证后得到表达麻雀防御素SBD10的工程菌株PET28a-SBD10/BL21，保藏编号为CCTCCNO：M2016058。

6.由权利要求4中所述的基因工程菌制备麻雀防御素SBD10的方法，包括接种、培养、诱导、破碎、纯化和复性，其特征在于：首先将工程菌株PET28a-SBD10/BL21接种于高盐(含8g/L的NaCl)LB培养基中，37℃摇床培养至OD600为0.6～0.8时，加入终浓度为0.4～0.8mM的诱导剂IPTG，37℃诱导表达3.5小时，离心收集菌体；预冷的PBS缓冲液(pH8.0)洗涤菌体，再用预冷的Tris-NaCl缓冲液(20mMTris，500mMNaCl，pH8.0)重悬菌体，超声破碎菌体，离心收集沉淀；用含6M盐酸胍的Tris-NaCl缓冲液重悬沉淀溶解包涵体蛋白，12000rpm离心10分钟，其上清液即为纯化前的样品。上清液经Ni-Agarose介质过滤，用含100mM咪唑的Tris-NaCl洗脱目标蛋白并透析复性，得到麻雀防御素重组蛋白SBD10。

7.权利要求2中所述麻雀防御素在防治畜禽病原菌感染上的作用。