[发明专利]一种麻雀防御素基因及表达产物

说明书

发明所属领域：

本发明涉及生物工程领域，具体说，本发明涉及一种麻雀防御素基因及其表达产物的制备和应用。

背景技术：

防御素是一类内源性抗菌肽，具有抗感染和免疫调节等作用，是动物体抵御外界致病性微生物侵袭的天然武器。防御素的抗微生物机理独特，不易产生耐药性，安全性高，因此在新药研发方面具有较高的开发价值和良好的应用前景(高小艳等，2010)。由于病原菌耐药、抗生素残留等问题频发，开发抗菌肽类药物已成为生物技术领域的热点研究方向之一。

根据防御素的氨基酸序列和分子结构的不同，可以将动物防御素分为三大类：α-防御素、β-防御素和θ-防御素。哺乳动物体内发现有α-防御素和β-防御素，少数灵长类动物体内发现有θ-防御素。已发现的禽类防御素均属于β-防御素。因此，禽类防御素又被称为禽β-防御素。禽类防御素的前体一般包括信号肽、前片段和成熟肽三部分，成熟肽分子量约3～4kDa。其中，成熟肽部分是最终发挥生物学活性的部分。禽类防御素具有良好的抗菌作用，但不同禽类防御素的抗菌谱和抗菌活性有差异。目前，已报道在鸡、鸭、鹅等家禽体内发现了多种禽类防御素或其基因。这些防御素的表达具有一定的组织特异性。天然的禽类防御素表达量较小，不易获取，人工合成防御素的成本又太高。因此，采用基因工程技术制备禽类防御素成为可取的研究方向。研究表明，基因工程表达的某些禽类防御素同样有抗菌活性(洪胜辉等，2010)，具备开发成抗菌制剂的潜力。

我国畜牧养殖业急需环保高效的抗菌药物替代部分抗生素，以减轻传统抗菌药物对环境和食品安全构成的威胁。防御素等新型抗菌药物的研发，能很好地解决这一问题。目前，我国禽源防御素的研究起步较晚，关注面也较窄，主要集中在家禽来源的防御素方面。寻找到抗菌活性高、抗菌谱广的禽源防御素，并解决其在人工表达中存在的表达量小、纯化困难等问题，是成功开发禽防御素药物的关键。为了提高防御素表达量，科研工作者常用多拷贝串联表达或与其它蛋白融合表达，但又面临表达蛋白活性降低、无抗菌活性、需要酶切去掉融合蛋白等问题。

发明技术内容：

本发明的目的之一在于提供一种麻雀防御素基因及其编码的氨基酸序列。

本发明的另一个目的是提供高效表达麻雀防御素的基因工程菌株及其构建方法，该菌株的表达产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等具有良好的抑菌活性，为防治畜禽病原菌感染提供了一种高效环保的抗菌蛋白。

本发明的再一个目的是提供用该工程菌株制备麻雀防御素的方法。

本发明的第四个目的是麻雀防御素应用于畜禽病原菌感染的防治。

本发明公开了一种新的麻雀防御素基因SBD10，其特征在于，该基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1所示。麻雀防御素基因SBD10通过RT-PCR技术获得：1)根据GenBank中收录的家禽防御素序列，选择其中的序列保守区段，用Primer5.0软件设计引物。上游引物为SEQIDNO:4所示,下游引物如为SEQIDNO:5所示；2)以麻雀肾脏组织总RNA作为模板，经两步法RT-PCR扩增得到麻雀防御素基因，基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，其发挥抗菌功能的成熟肽为SEQIDNO:3所示。

本发明还公开了一株可高效表达该麻雀防御素的基因工程菌及其构建方法。由麻雀肾组织总RNA作为模板经两步法RT-PCR扩增得到麻雀防御素基因，经过密码子改造插入载体PET28a(+)中得到重组表达质粒PET28a-SBD10，转化大肠杆菌BL21得到的基因工程菌，菌株名称为大肠杆菌PET28a-SBD10/BL21,EscherichiacoliPET28a-SBD10/BL21。该基因工程菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号CCTCCNO：M2016058，保藏日期是2016年1月22日。

大肠杆菌PET28a-SBD10/BL21，保藏编号CCTCCNO：M2016058的构建方法为：包括引物设计，重组表达质粒构建和宿主菌株转化，其特征在于：

1)所述的引物设计是根据GenBank中收录的家禽防御素序列，选择其中的序列保守区段，用Primer5.0软件设计引物,

上游引物如SEQIDNO:4所示,下游引物如SEQIDNO:5所示；