[发明专利]一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III和多种功能蛋白的方法

说明书

本发明提供一种从Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III的方法，该方法能提取出纯度近100％的AT‑III，并且比活和收率与现有方法相比都显著提高。此外，本发明还提供一种从Cohn法组分IV沉淀中综合提取利用α1‑抗胰蛋白酶、抗凝血酶III以及白蛋白的方法，在一条工艺路线上同时实现3种产品的分离提取，可有效降低α1‑抗胰蛋白酶和抗凝血酶III的生产成本，并可实现大规模工业化生产。本发明的方法能显著提高血浆综合利用效率，具有较强的应用价值。

技术领域

本发明属于血液制品领域，涉及血浆的综合利用，尤其涉及从制备人血白蛋白的废弃物中回收制备抗凝血酶III以及多种功能蛋白的方法。

背景技术

血液蛋白制品由健康人的血液、血浆或特异免疫人血浆分离提纯制成的有明确临床应用意义的血浆蛋白组分或血细胞组分制品，如人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子(天然或重组的)、红细胞浓缩物等，用于诊断、治疗或被动免疫预防，在临床上发挥着重要作用。

血浆蛋白的分离纯化，根据各种血浆蛋白的理化性质或生物特性的不同对其进行分离。目前采用的方法有低温乙醇法、层析法、盐析法、利凡诺沉淀法、聚乙二醇沉淀法和热乙醇法等等。其中低温乙醇法又称Cohn法，是由E.J.Cohn等发明的采用冷乙醇分离人血浆蛋白的方法，包括一系列改进。这些方法目前仍被国内外血液制品企业广泛采用。例如，美国、日本主要是用Cohn6+9法(Cohn-Oncley法)，而西欧国家则使用Nitschmann和Kistler法(简称N-K法)。我国的生产单位根据各自情况分别采用这两种方法。

Cohn法采用一系列不同浓度的乙醇对人血浆进行分级沉淀，富集和分离目标产品。以经典的N-K法为例，可把血浆蛋白分级为I–V的组分，其中分别制备成人血白蛋白(组分V)、凝血因子(组分I)和人免疫球蛋白(组分II+III)，组分IV则被当成废弃物。

表1. N-K法分离血浆蛋白的组分

Cohn组分IV沉淀(Cohn F IV)作为低温乙醇法中的废弃组分，其中含有多种具有药用价值的血浆蛋白。沉淀中的主要蛋白成分(见表1)为白蛋白和一些血浆中含量较少的微量蛋白，如运铁蛋白、AT-III(抗凝血酶III)、α1-AT(α1-抗胰蛋白酶)和结合珠蛋白等。这些蛋白中间，目前具有实际临床应用价值的蛋白主要是AT-III和α1-AT，其他几种微量蛋白在成药性方面目前还处于研究阶段。国外已有多种AT-III和α1-AT制品上市，而国内目前还没有AT-III和α1-AT制品进入市场，特别是在现在血浆蛋白产品市场供应短缺的情况下，从Cohn法组分IV沉淀中回收这些功能蛋白具有重要意义。

目前已有大量从Cohn法组分IV沉淀中回收单一功能蛋白的报道。例如，吴强等公开了一种从Cohn法组分IV沉淀中制备AT-III的方法，采用PEG沉淀加两步肝素亲和层析，获得的AT-III比活为6.9IU/mg，参见专利201210544111.X。采用这种方式制备AT-III在规模化生产时需要大量的PEG和肝素亲和凝胶，其最大的缺点就是制备成本较高。胡吉军等人公开了采用一步肝素亲和层析法从Cohn法组分IV沉淀中制备AT-III的专利，参见专利200310030446.4。这种方法虽然成本较小，但是制备的AT-III比活度不高，纯度也难达到100％。从组分IV沉淀中回收各种功能蛋白，在投浆量较小的情况下，如何既能有效的降低投入产出比，又能得到质量属性相对较高的产品是目前国内血液制品行业面临的一个难题，现有制备AT-III的主流工艺基本都采用PEG沉淀加肝素亲和层析或两步肝素亲和层析，且都是一种单一制品的制备模式，这些方式要么成本较高，要么质量标准不高。