[发明专利]一种测定运动小鼠胰腺组织样品中胰蛋白酶的方法

权利要求书

1.一种测定运动小鼠胰腺组织样品中胰蛋白酶的方法，包括以下步骤：

(1)取0.1～20μg肽固体分散在含5％戊二醛的PBS缓冲溶液中，持续搅拌2h后再向溶液中加入100μL浓度为0.1～1000m M的DNA1溶液，4℃振动孵育12h后，得肽修饰DNA1，即肽/DNA1，4℃下保存；

(2)首先将金电极分别用1.0μm，0.3μm，0.05μm氧化铝粉抛光，依次用蒸馏水，乙醇和蒸馏水分别超声5min，最后在0.1M的H₂SO₄溶液中进行循环伏安扫描直至电流电压曲线稳定；在洁净的金电极表面滴加(1)所得的1～60μL肽/DNA1溶液，在25℃下组装120min；修饰了肽/DNA1的金电极表面用去离子水洗净三次，用高纯氮气吹干；然后将金电极浸入1mM的巯基己醇溶液中，25℃下封闭60min，充分洗净后得肽/DNA1修饰金电极，4℃下保存备用；

(3)取1～60μL含0.001～400μM的H1和H2的混合溶液滴于(2)所得的肽/DNA1修饰金电极表面；在室温下反应一段时间后，再用50μL的PBST溶液洗涤三遍；然后再取1～60μL含0.001～400mM的亚甲基蓝溶液滴于电极表面，在室温下反应30分钟后，再用50μL的PBST溶液洗涤三遍；得H1、H2和亚甲基蓝自组装肽/DNA修饰金电极；

(4)将1～60μL胰蛋白酶样品溶液滴加到H1、H2和亚甲基蓝自组装肽/DNA修饰金电极表面，在室温下反应30min；然后，用磷酸缓冲溶液反复冲洗电极表面三次；以上述所得电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极，利用差分脉冲伏安法DPV在磷酸缓冲溶液中以1～1000mV/s的扫速进行扫描，电位扫描范围为-0.4到-0.1V；根据电化学信号对胰蛋白酶进行定量；

(5)小鼠运动方式采用一次性力竭性游泳，水温控制在32±1℃，小鼠游泳池规格为长100cm×50cm×50cm，小鼠持续下沉十秒不能露出水面为力竭标准；小鼠断头取材，按1:10加入匀浆介质后，将其制成组织匀浆，在3000转/分钟的条件下冷冻离心15min，取上清液按(4)所述方法测定胰蛋白酶；

其中所述的肽的序列和DNA的序列如下：

所述的肽的序列为GGRGGC；

所述的DNA1的序列为5′-TGA GGT AGT AGG TTG TAT AGT T-3′；

所述的H1的序列为5′-AGG GCG GGT GGG TTG TAT AGT AGG CAA AGT AAC TAT ACAACC TAC TAC CTC ATG GGT-3′；

所述的H2的序列为5′-TGG GTA CTT TGC CTA CTA TAC AA T GAG GTA GTA GGT TGTATA GTA GGG TAG GGC GGG-3′。

2.根据权利要求1的一种测定运动小鼠胰腺组织样品中胰蛋白酶的方法，其特征在于所述的PBST配制方法为：将磷酸缓冲溶液中加入Tween-20，使Tween-20的体积比为0.05％，即得PBST溶液。