[发明专利]检测EGFR和/或K-ras基因突变的引物、探针及试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测人类表皮生长因子受体(EGFR)基因和/或K‑ras基因的引物、探针，包含该引物和探针的试剂盒，以及一种基于数字PCR平台检测基因突变的装置。使用本发明的引物和探针检测基因突变的方法包括：提供所述引物及探针；提取待测样品的DNA；配制扩增突变基因序列的荧光PCR反应体系；用目标探针与内参探针分别与扩增产物杂交，并检测相应荧光基团的荧光信号；根据目标探针与内参探针的荧光信号的强度和比例，判断基因突变的存在和/或计算突变率。本发明的检测基因突变的方法所需引物及探针数量少，优化过程简单，可以定性或定量地检测EGFR和/或K‑ras基因的相关突变，且检测灵敏度高；对低起始量的DNA样本，也能够稳定检出。

技术领域

本发明涉及基因突变检测领域，具体地，涉及检测人类表皮生长因子受体(EGFR)基因和/或K-ras基因的突变的引物、探针，包含该引物和探针的试剂盒以及一种基于数字PCR平台检测基因突变的装置。

背景技术

根据国际癌症研究中心(IARC)估计，未来癌症发病人数年均将会以3％～5％的速度递增，预计2020年全球将有2000万新发病例，死亡病例将达1200万。从发病率来看，中低收入国家癌症发病率远高于发达国家。所以强调各国应当采取必要的预防措施。我国每年用于癌症病人的医疗费用约800亿元，约占卫生总支出的20％，远高于其他慢性病的医疗费用。近50年来，我国癌症的发生谱有明显的变化：原来高发的胃癌、宫颈癌、阴茎癌、食管癌和鼻咽癌等有不同程度的下降；而肺癌、乳癌、结肠癌和前列腺癌等发病率有明显上升。

肿瘤是一种多因素参与、多步骤发展的全身性、系统性疾病，癌症相关基因异常是导致肿瘤细胞出现逃避凋亡、无限复制、血管生成、侵袭及转移和免疫逃逸等异常生物学行为的根本原因。靶向治疗，是针对肿瘤细胞特有的靶点(如导致肿瘤细胞生长失控的基因靶点)设计结合药物，达到抑制肿瘤细胞分裂增殖。具有高选择性和低毒性，可以长期用药，从而可以在延长患者生存时间的同时改善生活质量。

21世纪以来，在临床肿瘤学领域内，分子靶向治疗(Molecular TargetedTherapy)的涌现已经为很多乳腺癌、淋巴瘤、肺癌、大肠癌、肾癌、白血病和胃肠间质瘤(GIST)等患者带来了生存希望。在短短的十数年间，先后涌现出针对肿瘤细胞增殖信号传导通路的利托昔单抗(美罗华)、曲妥珠单抗(贺赛汀)、吉非替尼(易瑞沙)、厄罗替尼(特罗凯)、伊马替尼和西妥昔单抗(爱必妥)以及针对肿瘤新血管生成的贝伐单抗(Avastin)、恩度(rh血管内皮抑素，endostar)等一大批分子靶向药物。索拉非尼是第一个获得FDA批准用于治疗晚期肾癌的药物，可使晚期肾癌患者的无进展生存期(PFS)延长一倍；替西罗莫司(temsirolimus)2007年经美国FDA批准用于晚期肾癌的治疗，2009年NCCN肾癌专家组将替西罗莫司作为高危转移性肾透明癌患者的一线治疗方案。口服的mTOR抑制剂依维莫司(everolimus)则在2010年经FDA批准上市。

近年来，以表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)和EGFR信号通路中关键的组分为靶标的分子靶标检测及靶向治疗成为国际肿瘤界个体化医疗关注的焦点。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，吉非替尼和厄罗替尼已被FDA批准用于治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)。这些靶向药物已应用于晚期和不适宜传统治疗方案的NSCLC患者的临床治疗。此外，范得他尼(Zactima)和索拉菲尼也都在进行临床试验，初步结果令人鼓舞。

EGFR主要位于细胞膜上，属受体酪氨酸激酶家族。EGFR被配体激活后启动胞内该通路上的信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增值、分化和凋亡。研究表明，在许多实体肿瘤中存在EGFR信号转导通路上的基因发生体细胞突变及表达异常，从而导致肿瘤细胞无限制的扩增和迁移。