[发明专利]一种用于植物显微结构观察的荧光染色方法

权利要求书

1.一种用于植物显微结构观察的荧光染色方法，其特征在于，由以下步骤实现：

1）.取材

取植物材料，切制成长宽各1-5mm的小块或小段；

所述的植物材料为花粉粒，胚囊、花柱、胚珠、叶片、根或茎；

2）.固定

室温下，将植物材料置于由pH8.0的PBS缓冲液配置成的质量浓度4%的多聚甲醛或甲醇中固定20-40min；

3）.第一次漂洗

从固定液中取出植物材料，用pH8.0的PBS缓冲液漂洗10-20min；

4）.染色

将漂洗后的植物材料滴加由质量浓度1-3%的DMSO0.02-0.1ml、质量浓度0.02-0.2%的TritonX-1000.02-0.1ml，0.05-0.2%的荧光增白剂2200.02-0.1ml制成的染色液，在室温下染色10-60min；

5）.第二次漂洗

将染色后的植物材料取出，放在载玻片上，用pH8.0的PBS缓冲液漂洗10-15min；

6）.核酸染色

二次漂洗后的植物材料滴加质量浓度0.01-0.05%的DAPI溶液0.02-0.06ml，室温下，对细胞中核酸进行荧光染色10-20min；

7）.封片

用蒸馏水漂洗，除去表面的染色液，再滴加质量浓度10-20%的甘油，将植物材料表面覆盖，加盖玻片；

8）.观察

用激光共聚焦显微镜观察照相，实现对植物显微结构的观察。

2.根据权利要求1所述的用于植物显微结构观察的荧光染色方法，其特征在于，由以下步骤实现：

1）.取材

取植物的花粉粒、胚囊、花柱或胚珠，或取叶片、根或茎切制成长宽各2-3mm的小块或小段；

2）.固定

室温下，将植物材料置于装有由pH8.0的PBS缓冲液配置成的质量浓度4%的多聚甲醛或甲醇制成的固定液的玻璃容器中，固定25-35min，当固定叶片时，用甲醇除去叶绿素，溶解角质层；

3）.第一次漂洗

从固定液中取出植物材料，用pH8.0的PBS缓冲液漂洗12-18min；

4）.细胞壁染色

将第一次漂洗后的植物材料放在双凹载玻片的圆凹中，滴加由质量浓度1.5-2.5%的DMSO的0.03-0.05ml、质量浓度0.05-0.15%的TritonX-1000.03-0.05ml、质量浓度0.1-0.15%的荧光增白剂2200.03-0.05ml制成的染色液，在室温下染色20-50min；

5）.第二次漂洗

将染色后的植物材料取出，放在载玻片上，用pH8.0的PBS缓冲液漂洗12-13min；

6）.核酸染色

二次漂洗后的植物材料滴加质量浓度0.02-0.04%的DAPI溶液0.03-0.05ml，室温下，对细胞中核酸进行荧光染色12-18min；

7）.封片

用蒸馏水漂洗，除去表面的染色液，再滴加质量浓度12-18%的甘油，将植物材料表面覆盖，加盖玻片；

8）.观察

用激光共聚焦显微镜观察照相，实现对植物显微结构的观察。

3.根据权利要求1所述的用于植物显微结构观察的荧光染色方法，其特征在于，由以下步骤实现：

1）.取材

取植物的花粉粒、胚囊、花柱或胚珠，或取叶片、根或茎切制成长宽各1-5mm的小块或小段；

2）.固定

室温下，将植物材料置于装有由pH8.0的PBS缓冲液配置成的质量浓度4%的多聚甲醛或甲醇制成的固定液的玻璃容器中，固定30min，当固定叶片时，用甲醇除去叶绿素，溶解角质层；

3）.第一次漂洗

从固定液中取出植物材料，用pH8.0的PBS缓冲液漂洗15min；

4）.细胞壁染色

将第一次漂洗后的植物材料放在双凹载玻片的圆凹中，滴加由质量浓度2%的DMSO的0.06ml、质量浓度0.11%的TritonX-1000.06ml、质量浓度0.12%的荧光增白剂2200.06ml制成的染色液，在室温下染色35min；

5）.第二次漂洗

将染色后的植物材料取出，放在载玻片上，用pH8.0的PBS缓冲液漂洗10min；

6）.核酸染色

二次漂洗后的植物材料滴加质量浓度0.03%的DAPI溶液0.06ml，室温下，对细胞中核酸进行荧光染色15min；

7）.封片

用蒸馏水漂洗，除去表面的染色液，再滴加质量浓度15%的甘油，将植物材料表面覆盖，加盖玻片；

8）.观察

用激光共聚焦显微镜观察照相，实现对植物显微结构的观察。