[发明专利]一种用于植物显微结构观察的荧光染色方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织观察，特别是一种用于植物显微结构观察的荧光染色方法。

背景技术

显微技术是研究植物科学的重要手段，目前对植物细胞和组织显微结构的研究仍然以光学显微镜为主，使用的主要是石蜡切片和超薄切片技术，但是制片方法复杂，需要时间长，不能快速制片，并且对实验的操作要求较高，需要相应的切片机和其他设备，最终得到的是二维图像，限制了广泛使用。

激光共聚焦显微镜能够对较厚、半透明甚至不透明的植物材料进行观察，能较为灵敏检测到荧光物质在细胞和组织中的分布，对细胞和组织进行无损伤的系列光学切片，得到各个层面的信息，经过电脑处理后可以得到其三维立体结构图像。植物整体装片和染色法可以在不破坏整体结构的条件下对样品进行处理，经过适当的荧光染料染色，结合激光共聚焦显微技术成为一种对植物材料进行快速制样与观察的手段。它不仅大大缩短样品准备所需时间，而且可以获得三维图象，在植物学研究中得到日益广泛的应用，但荧光染色如何应用于植物显微结构的观察上至今未见有行之有效方法的公开报导。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种用于植物显微结构观察的荧光染色方法，可有效解决快速制片，对植物显微结构的观察问题。

本发明解决的技术方案是，由以下步骤实现：

1.取材

取植物材料，切制成长宽各1-5mm的小块或小段；

所述的植物材料为花粉粒，胚囊、花柱、胚珠、叶片、根或茎；

2.固定

室温下，将植物材料置于由pH8.0的PBS缓冲液配置成的质量浓度4%的多聚甲醛或甲醇中固定20-40min；

3.第一次漂洗

从固定液中取出植物材料，用pH8.0的PBS缓冲液漂洗10-20min；

4.染色

将漂洗后的植物材料滴加由质量浓度1-3%的DMSO0.02-0.1ml（1-5滴，0.02ml/滴）、质量浓度0.02-0.2%的TritonX-1000.02-0.1ml（1-5滴，0.02ml/滴），0.05-0.2%的荧光增白剂2200.02-0.1ml（1-5滴，0.02ml/滴）制成的染色液，在室温下染色10-60min；

5.第二次漂洗

将染色后的植物材料取出，放在载玻片上，用pH8.0的PBS缓冲液漂洗10-15min；

6.核酸染色

二次漂洗后的植物材料滴加质量浓度0.01-0.05%的DAPI溶液0.02-0.06ml，室温下，对细胞中核酸进行荧光染色10-20min；

7.封片

用蒸馏水漂洗，除去表面的染色液，再滴加质量浓度10-20%的甘油，将植物材料表面覆盖，加盖玻片；

8.观察

用激光共聚焦显微镜观察照相，实现对植物显微结构的观察。

本发明方法简单，无需切片机，制片时间短，可以观察到植物的三维构造，适用于各种植物的细胞或组织的观察，清晰、准确，非常有利于对植物显微结构的分析研究，成本低，效果好，有良好的经济和社会效益。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。

实施例1

本发明在具体实施中，由以下步骤实现：

1.取材

取植物的花粉粒、胚囊、花柱或胚珠，或取叶片、根或茎切制成长宽各2-3mm的小块或小段；

2.固定

室温下，将植物材料置于装有由pH8.0的PBS缓冲液配置成的质量浓度4%的多聚甲醛或甲醇制成的固定液的玻璃容器中，固定25-35min，当固定叶片时，需用甲醇除去叶绿素，溶解角质层；

3.第一次漂洗

从固定液中取出植物材料，用pH8.0的PBS缓冲液漂洗12-18min；

4.细胞壁染色

将第一次漂洗后的植物材料放在双凹载玻片的圆凹中，滴加由质量浓度1.5-2.5%的DMSO0.03-0.05ml、质量浓度0.05-0.15%的TritonX-1000.03-0.05ml、质量浓度0.1-0.15%的荧光增白剂2200.03-0.05ml制成的染色液，在室温下染色20-50min；

5.第二次漂洗

将染色后的植物材料取出，放在载玻片上，用pH8.0的PBS缓冲液漂洗12-13min；

6.核酸染色