[发明专利]用于定量检测RPRM基因DNA甲基化试剂盒及方法

说明书

本发明提供了用于定量检测RPRM基因DNA甲基化试剂盒及方法，所述的试剂盒包含：重亚硫酸盐转化反应液，玻璃纤维膜离心柱，结合缓冲液，漂洗缓冲液、脱硫缓冲液，洗脱缓冲液，2×SYBR GREEN I预混反应液，引物RPRM‑F与RPRM‑R，甲基化阳性对照质粒S_M及非甲基化阳性对照质粒S_U。在2小时内完成对DNA的重亚硫酸盐转化，经纯化后，通过特异的引物对转化后的RPRM基因DNA区域进行PCR扩增，然后进行甲基化敏感的熔解曲线分析（MS‑MCA），从而检测是否有RPRM基因的甲基化及甲基化的程度。该方法以血浆为检测样本，操作程序大为简化、灵敏度高、特异性好、检测结果稳定，有重要的应用前景。

技术领域

本发明的属于生物技术领域，具体涉及用于定量检测RPRM基因DNA甲基化试剂盒及方法。

背景技术

DNA甲基化作为最基本的表观遗传学调控机制，是肿瘤中最常见的基因分子改变之一，尤其表现在肿瘤抑制基因与错配修复基因上，能导致基因编码区的突变和使基因失活而有利于肿瘤的发展，是癌症发生的重要指标之一。人类不同类型的癌症基因甲基化模式图谱的建立是相关领域研究的一项重要内容。目前已在肺癌、胃癌、头部和颈部癌症、膀胱癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、和胆囊癌等中发现基因的异常甲基化。

RPRM基因的全称：reprimo, TP53 dependent G2 arrest mediator candidate，是一种p53肿瘤抑制因子诱导表达的基因，位于染色体2q23位点上，该位点等位基因失衡已被证明与肺癌、乳腺癌和结肠癌等相关联。在许多癌症和肿瘤细胞株的检测中，都发现了RPRM基因的异常甲基化，包括胃癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、大肠癌、食道癌、胆囊癌、淋巴瘤、白血病、乳腺癌患者。特别是在早期胃癌的血浆样品检测中，只有RPRM有高甲基化频率（> 70％），而正常的对照血浆无明显的经常性甲基化，说明发现于癌症的RPRM甲基化，很少发生在非恶性的组织中。因此，RPRM甲基化作为胃癌早期血清学活检的生物标志物是有潜力的。另一方面，胃癌患者RPRM甲基化检测并与胃黏膜萎缩标记和幽门螺杆菌检测相结合有可能建立起胃癌早期检测的指标。此外，由于RPRM甲基化是胃癌患者的重要指标之一，有可能用于胃癌的预后检测中。目前RPRM甲基化检测已在美国被批准进入临床试验阶段。因此，RPRM基因甲基化，作为癌症诊治中重要的血清分子标志物，可以作为诊断和治疗中的一项重要参考依据。

基因甲基化主要发生于CpG位点的C（即胞嘧啶）上，在重亚硫酸盐的作用下，胞嘧啶将转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，再进一步通过DNA测序分析等方法，区别胞密啶及尿密啶。因此，通过重亚硫酸盐转化可以区别胞嘧啶的甲基化或者非甲基化。本发明，改进了重亚硫酸盐转化的方法，并通过建立甲基化修饰及非修饰内参质粒，配合实时PCR的方法及阈值截取，将重亚硫酸盐转化PCR方法加以优化，进行DNA甲基化敏感的熔解曲线分析，达到对DNA甲基化进行定量检测的目的。该方法不仅可用于定量检测RPRM基因DNA甲基化，也可用于定量检测其他基因DNA甲基化，且免除了DNA测序的步骤，而且对甲基化的程度可以加以定量分析，操作较为简便，成本较低，非常适合于未来大量样本的高通量分析。

发明内容

本发明的目的在于提供用于定量检测RPRM基因DNA甲基化试剂盒及方法，该方法不仅可用于定量检测RPRM基因DNA甲基化，也可用于定量检测其他基因DNA甲基化，且免除了DNA测序的步骤，而且对甲基化的程度可以加以定量分析，操作较为简便，成本较低，非常适合于未来大量样本的高通量分析。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

用于定量检测RPRM基因DNA甲基化试剂盒，包含：DNA转化试剂组分（重亚硫酸盐转化反应液），DNA纯化试剂组分（玻璃纤维膜离心柱，结合缓冲液，漂洗缓冲液、脱硫缓冲液，洗脱缓冲液），甲基化检测试剂组分（2×SYBR GREEN I预混反应液，引物RPRM-F与RPRM-R，甲基化阳性对照质粒S_M及非甲基化阳性对照质粒S_U）。