[发明专利]一种基因组DNA的PCR-free测序文库制备方法

权利要求书

1.一种基因组DNA的PCR-free测序文库制备方法，具体包括以下步骤：

(1)对基因组DNA进行超声打断；

(2)对超声打断的片段进行纯化回收；

(3)利用NEB末端修复试剂对纯化产物进行末端修复；

(4)对末端修复产物进行纯化回收；

(5)利用NEB末端加A试剂对上述纯化产物进行DNA末端加A反应；

(6)对上述加A产物进行纯化回收；

(7)对上述纯化产物进行连接反应，本发明专利设计了多种兼容于Illumina二代测序仪的测序接头，接头序列含有标签(Index)序列，可同时对多个样品进行标记，接头引物合成采用HPLC，使用前需进行一定条件的处理；

接头序列为：

P5(5’-3’):AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T(SEQIDNo.1)

P7(5’-3’):/5’Pho/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(SEQIDNo.2)其中P7引物序列种的六碱基序列NNNNNN代表标签(Index)序列，标签(Index)序列用于标记不同的样品，可以将带不同标签(Index)序列的样品构建混合文库；

(8)对连接产物进行片段筛选，回收产物即为测序文库；

(9)对文库进行质检和上机测序，检测测序文库的浓度和片段大小，利用Illumina公司的二代测序仪对浓度和片段大小符合要求的文库进行高通量测序。

2.根据权利要求1所述的一种基因组DNA的PCR-free测序文库制备方法，其特征在于：步骤(1)中，打断范围为插入片段insert300bp和insert500bp两种，打断选用CovarisM220超声打断仪，打断参数依次是占空因数(Dutyfactor)设置为20％，峰值功率(Peakincidentpower)设置为50W，循环破碎系数(Cyclesperburst)设置为200，工作温度设置为20℃，两种不同的打断范围insert300bp打断持续时间70秒(sec)，insert500bp打断持续时间42sec，基因组DNA打断起始量为1μg-6μg之间，打断体系为130μL。

3.根据权利要求1所述的一种基因组DNA的PCR-free测序文库制备方法，其特征在于：所述步骤(2)、(4)、(6)的纯化为用磁珠进行纯化，磁珠选用AMpureXPBreads，纯化时磁珠用量均为1.6×(体积为所纯化的溶液体积的1.6倍)，其中，步骤(2)也可选用PCR产物试剂盒(QIAGEN(货号Cat.no.28704))进行纯化回收。

4.根据权利要求1所述的一种基因组DNA的PCR-free测序文库制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，采用NEB修复试剂，体系为修复试剂5μL，10×修复缓冲液试剂10μL，片段化DNA溶液85μL，总体系为100μL，修复条件为20℃，60分钟(min)；4℃，终止(hold)。

5.根据权利要求1所述的一种基因组DNA的PCR-free测序文库制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中，采用NEB加A反应试剂，体系为10×加A反应缓冲液试剂5μL，克列诺片段(KlenowFragment，3′→5′exo^-)3μL，修复DNA溶液42μL，总体系50μL，连接条件为37℃，60min；4℃，hold。