[发明专利]一种基因组DNA的PCR-free测序文库制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学中高通量测序技术的领域。更具体涉及一种基因组DNAPCR-free测序文库制备方法，它适用于基因组DNA不经过PCR扩增就进行文库构建的样品。

背景技术

二代测序技术是现代分子生物学高通量测序研究中最常用的技术。由于传统的一代测序已经不能完全满足研究者的需要，对模式生物进行基因组重测序以及非模式生物基因组测序都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，因而催生了第二代测序技术(Next-generationsequencing)。现有第二代测序技术平台主要包括Roche/454FLX、Illumina/SolexaGenomeAnalyzer和AppliedBiosystemsSOLIDsystem三种，其核心原理是边合成边测序(SequencingbySynthesis)，即通过捕捉新合成的末端标记碱基信息来确定DNA的序列。这三种测序平台各有优点，其中454FLX的测序读长(Read)最长，Solexa测序性价比最高，SOLID测序的准确度最高。这三种测序平台中Illumina公司的测序仪器占了全球市场七成的份额，其Solexa的升级版Hiseq系列是目前使用最多的测序仪。Hiseq测序平台单次反应的数据量由最初几十G已提升到1.5～1.8Tb，极大的降低了测序成本，使得一千美金测一个人类基因组已经成为了可能。目前第三代测序技术(单分子测序技术)仍旧存在准确度和通量不高等缺点，部分三代测序仪还处于研发和测试阶段，而二代测序技术自身也会在不断完善和发展，因此，在今后相当长的一段时间内二代测序还是占据主流。第二代测序技术对DNA测序的主要原理是先将的DNA进行片段化，片段化DNA末端修复，然后在两侧加上特异的接头，随后用不同的方法产生几百万个空间固定的PCR克隆阵列，利用引物杂交和酶延伸反应对每个延伸反应所掺入的荧光标记进行成像检测就可获取测序数据。

二代测序对DNA进行测序主要包括到文库制备和上机测序两个过程。在文库制备过程中，一般通过标准的PCR来扩增随机打断的基因组片段。但对于一些特殊模板，存在二级结构复杂或者热稳定性不好因素，从而影响模板PCR的扩增偏好，所以并非所有基因组序列都能在PCR扩增文库中同等体现。特别是对一些高GC或者高AT含量的模板，有时很难用PCR方法来扩增进行文库构建。PCR-free文库和常规PCR文库上机测序时并没区别，只是建库过程中不做PCR，PCR-free文库理论上可以改善数据读取分布并产生更均一的基因组覆盖。采用Illimina公司测序仪对文库上机测序时，PCR-free文库和常规PCR文库的簇扩增相似，不过也存在一些差异，其差异主要在于构建接头的方式。在Illimina测序仪的Flowcell上簇扩增的接头包含一些额外的序列，能帮助与连接在流动槽表面的单链DNA进行分子杂交，流动槽本身会选择完全相连的模板分子且只扩增与接头序列完全连接的模板链，簇扩增便开展了类似普通PCR文库构建时的PCR富集扩增，这样可降低文库构建时PCR扩增引入的错误碱基和由此造成的偏向性。Illumina的TruSeqDNAPCR-free样品制备试剂盒采用了一种基于磁珠的流程，理论上可在一天内完成，并可与Illumina测序平台不断增加的读长兼容。但此试剂盒价格昂贵，单次建库成本高。另外，由于全程采用的是磁珠纯化的流程，其缺点是插入片段分布较宽，尤其在小片段区域分布较多，容易导致序列在两端测序时被测穿而产生数据浪费。综上，PCR-free文库是一种建库方法的补充，由于不进行PCR扩增而直接制备成上机文库，可提高一些高GC或者高AT区域的覆盖度，从而减少了PCR引入的错误碱基、数据偏向以及序列重复。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种新的快速高效的可应用于Illumina二代测序平台的基因组DNA的PCR-free测序文库制备方法。此方法不进行PCR扩增而直接制备成上机文库，可提高一些高GC或者高AT区域的覆盖度，从而减少了PCR引入的错误碱基、数据偏向以及序列重复。因此，此方法特别适用于高GC或者高AT含量的基因组DNA或者为了降低非模式生物DNADenovo测序中碱基错误率和序列重复的文库构建。

本发明提供以下技术方案：

本发明提供的基因组DNA的PCR-free测序文库制备方法具体流程为：具体包括以下步骤：

(1)对基因组DNA进行超声打断；

(2)对超声打断的片段进行纯化回收；

(3)利用NEB末端修复试剂对纯化产物进行末端修复；