[发明专利]用于治疗肝衰竭的干细胞制剂及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，特别涉及一种用于治疗肝衰竭的干细胞制剂及其制备方法和应用。

背景技术

我国慢性乙型肝炎约三千多万人，其中肝硬化的年发生率约3％，5年累计发生约16％，乙肝肝硬化代偿期或失代偿期的5年病死率分别是14％～20％和70％～80％，临床上最终表现为慢性肝功能衰竭症状。加上酒精、自身免疫或继发性损害等，导致发生肝功能衰竭的患者为数众多，既成为社会负担，也为临床治疗带来了难题。原位肝移植因其能够从根本上改善肝功能、延长发生肝衰竭患者的生存期成为一种较好的治疗方法，但由于缺乏供体，手术风险大，费用昂贵，存在免疫排斥反应等因素限制了其广泛应用。血浆置换、白蛋白透析等辅助性人工肝技术的应用，虽可暂时缓解病情，改善症状，肝功能得到一定改善，但对中晚期肝衰竭患者疗效不佳，且目前血液制品来源紧张，费用相对昂贵，也限制了人工肝技术的应用。常见的内科综合治疗虽能暂时解除患的痛苦，但不能从根本上解决病情。

间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCS)是中胚层来源的成体干细胞，由于来源广泛、扩增潜能巨大、横向分化能力强，以及可以逃避免疫识别和抑制免疫反应等其它干细胞无法比拟的优势，目前备受研究人员关注。近来有研究报道，在骨髓、软骨和脂肪组织之外的脐带血和脐带等胎儿附属组织中发现了MSCS。

间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的一种成体干细胞，其具有强大的增殖和多向分化的潜能，免疫原性低，并能在体内外分化为肝细胞、肌细胞和成骨细胞等，对于治疗乙肝等肝脏疾病的研究有着重要的意义。目前有研究表明，采用间充质干细胞制成的单一细胞制剂能够在一定时间内修复肝功能，但修复效率差，且无法达到长久修复的目的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中用于治疗肝衰竭的药物疗效差等缺陷，提供一种能够提高肝衰竭疗效的用于治疗肝衰竭的干细胞制剂及其制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于治疗肝衰竭的干细胞制剂，包括间充质干细胞和血管内皮细胞。

在本发明提供的用于治疗肝衰竭的干细胞制剂中，所述干细胞制剂中，所述间充质干细胞的浓度为(4～6)×10⁶个/ml，所述血管内皮细胞的浓度为(1～2)×10⁶个/ml。

在本发明提供的用于治疗肝衰竭的干细胞制剂中，还包括干细胞因子、黄芪、岩藻多糖和Y-27632。

在本发明提供的用于治疗肝衰竭的干细胞制剂中，所述干细胞制剂中，

干细胞因子的浓度为10～200μg/ml、

黄芪的浓度为100mg/L～200mg/L、

岩藻多糖的浓度为1～100μg/mL、

和Y-27632的浓度为10～50μM。

在本发明提供的用于治疗肝衰竭的干细胞制剂中，所述干细胞制剂中，还包括质量分数为2.5～5.0％的枸橼酸钠。

在本发明提供的用于治疗肝衰竭的干细胞制剂中，所述干细胞制剂中，

间充质干细胞的浓度为5×10⁶个/ml、

血管内皮细胞的浓度为1.5×10⁶个/ml、

干细胞因子的浓度为100μg/ml、

黄芪的浓度为150mg/L、

枸橼酸钠的质量分数为3.8％、

岩藻多糖的浓度为50μg/mL、

和Y-27632的浓度为30μM。

本发明进一步保护上述用于治疗肝衰竭的干细胞制剂的制备方法，

获取间充质干细胞的过程包括以下步骤：

无菌环境下，取脐带，用含有双抗的PBS溶液清洗，剪切成组织块，并用培养基湿润所述组织块；然后，添加间充质干细胞生长培养基进行培养，每2～4天更换间充质干细胞生长培养基；当细胞贴壁生长达70％以上汇合后，弃组织块，胰酶消化，待细胞间隙增大，胞质回缩，用血清终止消化，制成单细胞悬液，离心后重悬细胞，按1：2～1：3的比例进行传代培养至收获第3～5代中任一代间充质干细胞。

获取血管内皮细胞的过程包括以下步骤：

取所述第3～5代中任一代间充质干细胞，以(3～6)×10⁵个/皿的密度接种，加入诱导培养基诱导培养至间充质干细胞转化为原代血管内皮细胞，再对所述原代血管内皮细胞进行传代扩增培养至收获第3～5代中任一代血管内皮细胞。