[发明专利]一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活剂的制备方法

权利要求书

1. 一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf 2-ARE通路激活剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）金枪鱼碎肉的酶解：取金枪鱼碎肉匀浆，按固液比1g:10mL～15mL加入Gly-NaOH缓冲液，用HCl或NaOH调节pH到9.0～10.0，将溶液温度调制55～65℃，按照金枪鱼碎肉质量的1.0%～1.5%加入碱性蛋白酶，酶解时间3.5h～4.0h后，酶解液于90～95℃保温10～15min，灭酶活；将酶解液温度调至45～55℃，调节pH到6.0～7.0，按照金枪鱼碎肉质量的0.8%～1.0%加入复合风味蛋白酶，酶解时间2.5h～3.0h，酶解液于90～95℃保温10～15min后降至室温，于8000～10000rpm离心15～20min，取上清液；

2）金枪鱼碎肉高F值寡肽的制备：取上述上清液，采用1kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，得超滤酶解液；将超滤酶解液调pH值至2.5~3.5，按照物料与活性炭颗粒比为10～15:1将超滤酶解液以0.3～0.5mL/min流速缓慢加入到装载有活性炭颗粒的玻璃柱中，上样完成后，采用2～3倍柱体积的1：1比例的1mol/L氨水和无水乙醇混合溶液洗脱色谱柱，收集洗脱液，干燥，得活性炭精制多肽；将活性炭精制多肽配成10～20mg/mL的溶液，调pH值至6.5～7.5，缓慢加入到物料与D101大孔树脂比为10～15:1的装载D101大孔树脂的玻璃柱中，用2～3倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质，再用2～3倍柱体积的95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱物，喷雾干燥，即为金枪鱼碎肉高F值寡肽；

3）金枪鱼碎肉高F值寡肽中Nrf 2-ARE通路激活剂制备：将金枪鱼碎肉高F值寡肽依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得Nrf 2-ARE通路激活剂；

其中所述步骤1）中的Gly-NaOH缓冲液为0.05mol/L，pH值为9.5；碱性蛋白酶的酶活力≥1.95×10⁵U/g；复合风味蛋白酶的酶活力≥1×10³LAPU/g；

所述步骤1）中的金枪鱼为鲣鱼即Katsuwonus pelamis；

所述步骤3）的凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为：

凝胶柱层析：将上述大孔树脂精制多肽溶于双蒸水配成浓度为20～30mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速为0.5～0.8mL/min，洗出溶液每3min收集一管并于220nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰对Nrf2蛋白质水平的影响，选择Nrf 2蛋白质水平最高组分冻干，即为凝胶层析酶解物；

反相高效液相色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成90～100μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，收集对Nrf2蛋白质累计水平最高的多肽，经反相高效液相色谱检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Ile-Glu-Leu-Val-Trp，ESI-MS测定分子量为658.76 Da；所述反相高效液相色谱条件为：进样量10～15μL；色谱柱是规格为250mm×4.6mm，填料颗粒直径为5μm的KromasilC18；流动相为水-乙腈梯度洗脱，0～40min乙腈浓度，由0匀速升至50%；洗脱速度0.8~1.0mL/min；紫外检测波长220nm。