[发明专利]一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活剂的制备方法

说明书

本发明公开了一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2‑ARE通路激活剂的制备方法。本发明以金枪鱼碎肉为原料，通过双酶酶解得酶解液，酶解液采用超滤、活性炭吸附和大孔树脂纯化得金枪鱼高F值寡肽，再利用凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到活性多肽Ile‑Glu‑Leu‑Val‑Trp，ESI‑MS测定分子量为658.76 Da；制备的高活性多肽对羟自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时亦可促进Nrf2蛋白质积累，激活Nrf2‑ARE通路，可用作治疗肝损伤、皮肤光老化、衰老等与Nrf2‑ARE通路密切相关疾病治疗的药物和功能产品。

技术领域

本发明涉及一种Nrf2-ARE通路激活剂的制备方法，具体涉及一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活剂的制备方法。

背景技术

高F 值寡肽混合物是一个由由3～7个氨基酸残氨基酸残基所组成的混合小肽（或称寡肽）体系。F值（Fischer ratio）是指支链氨基酸（BCAA：Val，Ile，Leu）与芳香族氨基酸（AAA：Trp，Tyr，Phe）含量的摩尔数比值。正常人的血液中F值为3.0-3.5，而患有肝脏疾病病人的F值只有1.0或者更低，而高F值寡肽的F值应大于20，远高于人体中这两类氨基酸的比值。由于它具有独特的氨基酸组成和生理功能，已经受到食品和医药界的高度关注。

鲣鱼（Katsuwonus pelamis），属鲈形总目、金枪鱼亚目、金枪鱼科、舵鲣亚科、鲣属，又名正鲣、炸弹鱼、坚鱼、松鱼、飞虎鱼。鲣鱼是大洋性重要经济鱼。鲣鱼分布范围较广，在印度洋、太平洋和大西洋水温高于15 摄氏度以上的水域，都有鲣鱼的踪迹，并且储量丰富、开发利用前景乐观。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活剂的制备方法。

本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活剂的制备方法，其包括以下步骤：

1）金枪鱼碎肉的酶解：取金枪鱼碎肉匀浆，按固液比1 g:10mL～15 mL加入Gly-NaOH缓冲液（0.05mol/L，pH 9.5），用HCl或NaOH调节pH到9.0～10.0，将溶液温度调制55～65℃，按照金枪鱼碎肉质量的1.0 %～1.5 %加入碱性蛋白酶（酶活力≥1.95×10⁵ U/g），酶解时间3.5 h～4.0 h后，酶解液于90～95℃保温10～15min，灭酶活；将酶解液温度调至45～55℃，调节pH到6.0～7.0，按照金枪鱼碎肉质量的0.8 %～1.0%加入复合风味蛋白酶（酶活力≥1×10³ LAPU/g），酶解时间2.5 h～3.0 h，酶解液于90～95℃保温10～15min后降至室温，于8000～10000 rpm离心15～20 min，取上清液。

2）金枪鱼碎肉高F值寡肽的制备：取上述上清液，采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液；将超滤酶解液调pH值至2.5~3.5，按照物料与活性炭颗粒比为10～15:1将超滤酶解液以0.3～0.5mL/min 流速缓慢加入到装载有活性炭颗粒的玻璃柱中，上样完成后，采用2～3倍柱体积的1：1比例的1mol/L氨水和无水乙醇混合溶液洗脱色谱柱，收集洗脱液，干燥，得活性炭精制多肽；将活性炭精制多肽配成10～20 mg/mL的溶液，调pH值至6.5～7.5，缓慢加入到物料与D101大孔树脂比为10～15:1的装载D101大孔树脂的玻璃柱中，用2～3倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质，再用2～3倍柱体积的95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱物，喷雾干燥，即为金枪鱼碎肉高F值寡肽。

3）金枪鱼碎肉高F值寡肽中Nrf2-ARE通路激活剂制备：将金枪鱼碎肉高F值寡肽依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得Nrf2-ARE通路激活剂。

作为优选，所述步骤1）中的金枪鱼为鲣鱼（Katsuwonus pelamis）。