[发明专利]一种应用内参基因快速检测肉制品中羊源性成分含量的方法

权利要求书

1.用于鉴定羊源性成分含量的PCR扩增引物及探针引物，其特征在于，包括内参基因16SrDNA引物正向序列：5′-GTCCATATCGACGAGAGG-3′，16SrDNA反向序列：5′-GTAGGACTTTAATCGTTGAACA-3′，16SrDNA探针序列：5′-FAM-TTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACA-TAMRA-3′；外源种属特异性基因OA-PRLP引物正向序列：5′-CAACATGCCTTTAAACCCTCAAA-3′，OA-PRLP反向序列：5′-TGTAGCCTTCTGACTCGCTCTGT-3′，OA-PRLP探针序列：5′-FAM-ACCATTGAGACTGGCGG-TAMRA-3′；

2.一种采用权利要求1所述内参引物和外源种属特异性引物，快速鉴定羊源性成分含量的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)采用权利要求1所述的内参基因PCR引物及Premix Ex Taq(Probe qPCR)预混液，加入供试样品模板DNA进行PCR扩增；其中的PCR扩增反应体系：扩增反应的总体积为20μL，其各种成分分别为：2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)预混液10μL，上下游引物各1μL，探针引物0.5μL，模板DNA 1μL，用灭菌去离子水补齐至20μL；

反应程序：95℃变性2min；进行45次循环扩增反应(95℃变性15s，60℃退火延伸1min)；在第二阶段的退火延伸(60℃)时段收集荧光信号。

(2)构建羊源性成分定量检测的标准参照物，采取SDS-硅胶柱改良方法提取DNA梯度稀释，配制标准曲线。标准溶液中羊源性成分的浓度为50、5、0.5、0.05、0.005ng/μL，每个反应加入1μL DNA做模板，每个反应分别对应50、5、0.5、0.05、0.0005ng。每个反应设置3个平行。根据标准DNA溶液PCR反应的Ct值及初始模板浓度的对数分别绘制16SrDNA和羊的标准曲线；

(3)设定阈值后，荧光定量PCR仪的数据分析软件自动计算每个反应的Ct值和靶标浓度，并记录。将羊源性成分种属特异性基因的靶标浓度除以16SrRNA内参基因的靶标浓度，计算出试样中羊源性成分种属特异性基因百分含量。

3.如权利要求2所述的鉴定方法，其中每条引物分别配制成浓度为100μmol/L的贮存液，工作浓度为10μmol/L。

4.如权利要求2所述的鉴定方法，其中模板浓度为50～100ng/μL。