[发明专利]一种应用内参基因快速检测肉制品中羊源性成分含量的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学分析领域，具体涉及肉制品中羊源性成分含量的鉴定方法，是一种在实时荧光定量PCR技术基础上利用内参基因校正外源种属特异性基因对羊源性成分进行定量检测的方法。

背景技术

多源化的肉类品种是人们餐桌文化日趋丰富的重要组成部分，然而随着市场上牛羊肉价格的不断大幅上涨，部分不法企业及商贩，为了自身经济利益的最大化，在高成本的牛肉或羊肉中掺入低廉的其他肉类品种，或通过牛羊油浸泡、作料添加等方式处理后冒充牛羊肉进行销售。

因此，大力提高市场监管水平，配合营养标签制度的顺利实施，适时修订和完善技术标准，依据掺假轻重情节(即掺假量化数值)针对性地加大处罚及治理力度，稳定市场秩序已显得尤为重要，然而，要想达到及时有效的市场监管效果，快速、精准、量化的肉类鉴别方法是必不可少的关键技术手段。

传统的肉类鉴别方法对熟肉制品的检测有很大的局限性，如耗时长、操作繁琐、费用昂贵、无法鉴别近缘品种、不能量化样品中异源动物成分含量等问题。因此，基于时效性和准确性上的优势，实时荧光定量PCR技术成为检测动物源性成分最常用的分子生物学方法。

然而，周彤等指出经多次高温烘焙会对DNA造成一定的损伤，所以如果标准品采用未经高温烘焙的肉源品种，待测样品和标准品DNA的断裂程度相差太大，必然会造成结果大幅偏低，让执法者造成误判，因此要想将实时荧光定量PCR技术发展成为分析动物源性食品掺假量化判定的一种有效方法，引入合适的内参基因对肉源品种的整体DNA损伤程度和提取效率进行监控，校正外源种属特异性基因百分含量，消除量值结果的偏差是技术的关键，由此才可获得真实可信的食品掺假数值，有效提高检测方法的灵敏度和准确性。

虽然在目前的相关研究以及国家、商检的检测标准中并没有明确的将内参基因的职能定义为外源种属特异性基因量值判定的校正因子，只是将其作为监控反应正常进行与否，防止假阴性结果出现的定性判定指标，但内参基因的校正量化运用必将成为实时荧光定量PCR技术量化定值判定方法的发展趋势。国家相关标准只能进行成分定性检测，无法进行准确定量检测，即只能检测肉制品中是否含有其他成分，比例无法确定。

本发明旨在建立鲜冻畜、禽肉中羊源性成分的定量检测方法，该方法简单易行、灵敏、快速、费用低、便于推广，为动物源成分量化掺伪鉴定提供科学可靠的技术手段。

发明内容

本发明的目的在于克服传统的肉类鉴别方法耗时长、操作繁琐、不能量化样品中异源动物成分含量等缺点，公开了一种应用内参基因快速检测肉制品中羊源性成分含量的方法。本发明的羊源性成分含量鉴定方法具有简单易行、快速灵敏、费用低、便于推广等优势。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

用于鉴定羊源性成分含量的PCR扩增引物及探针引物，其特征在于，包括内参基因16SrDNA引物正向序列：5′-GTCCATATCGACGAGAGG-3′，16SrDNA反向序列：5′-GTAGGACTTTAATCGTTGAACA-3′，16SrDNA探针序列：5′-FAM-TTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACA-TAMRA-3′；外源种属特异性基因OA-PRLP引物正向序列：5′-CAACATGCCTTTAAACCCTCAAA-3′，OA-PRLP反向序列：5′-TGTAGCCTTCTGACTCGCTCTGT-3′，OA-PRLP探针序列：5′-FAM-ACCATTGAGACTGGCGG-TAMRA-3′。

本发明所述快速检测羊源性成分含量的方法，该方法以供试样品基因组DNA为模板，应用内参基因校正外源种属特异性基因计算羊源性成分含量，其包括如下步骤：

(1)采用内参基因PCR引物及Premix Ex Taq(Probe qPCR)预混液，加入供试样品模板DNA进行PCR扩增；其中的PCR扩增反应体系：扩增反应的总体积为20μL，其各种成分分别为：2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)预混液10μL，上下游引物各1μL，探针引物0.5μL，模板DNA 1μL，用灭菌去离子水补齐至20μL；

反应程序：95℃变性2min；进行45次循环扩增反应(95℃变性15s，60℃退火延伸1min)；在第二阶段的退火延伸(60℃)时段收集荧光信号。